白藜芦醇调节微小RNA-29b表达抑制高糖诱导的大鼠视网膜muller细胞凋亡

曾凯宏，王 元，邓 波，余雪梅，宋 怡，周 雪，黄璐娇

(1．四川省医学科学院．四川省人民医院临床营养科，四川 成都610072;2．电子科技大学医学院，四川 成都610054)

白藜芦醇调节微小RNA-29b表达抑制高糖诱导的大鼠视网膜muller细胞凋亡

曾凯宏1，2，王 元2，邓 波1，余雪梅1，宋 怡1，周 雪1，黄璐娇1

(1．四川省医学科学院．四川省人民医院临床营养科，四川 成都610072;2．电子科技大学医学院，四川 成都610054)

目的 研究白藜芦醇(RSV)防护糖尿病早期视损伤的分子机制。方法通过建立视网膜muller细胞(RMCs)体外高糖模型，采用免疫荧光双标、qRT-PCR、western blot、Annexin V/PI流式细胞技术检测高糖和RSV对微小RNA-29b(miR-29b)、特异蛋白1(SP1)表达及RMCs凋亡的影响。结果高糖培养后，miR-29b和SP1表达明显改变，RMCs凋亡率明显增加，RSV干预可明显抑制高糖诱导的miR-29b和SP1异常表达和RMCs凋亡;通过预先在RMCs中转染miR-29b类似物和miR-29b抑制剂研究发现，RSV抑制凋亡作用受明显影响(P＜0.05)。结论RSV通过调节miR-29b表达发挥抗糖尿病早期视损伤作用。

白藜芦醇;微小RNA-29b;特异蛋白1;糖尿病视网膜病变;凋亡，

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最为常见的并发症之一，是世界范围内致盲的主要眼病，国内外目前尚无有效治疗措施［1，2］。大量研究表明，在DR早期视网膜微血管病变之前即可检测到视网膜muller细胞(retinal muller cells，RMCs)凋亡［3～5］。Silva 等［6］研究 DR 早期神经细胞微小RNA(MicroRNA，miRNA)表达时发现，miR-29b在DR早期RMCs凋亡中起重要作用。miR-29b通过调节转录因子特异蛋白1(Specificity protein 1，SP1)表达参与 DR早期 RMCs凋亡。白藜芦醇(resveratrol，RSV)是葡萄、花生、决明子和虎杖等天然植物中的一种有效成分，具有广泛的生物学和药理学作用［7］。近年研究发现，RSV不仅能降低 DR大鼠血糖水平，抑制胰岛β细胞凋亡，还能增加DR大鼠肌细胞、肝细胞及脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力，增加肝细胞的糖原合成能力等［8，9］。RSV对DR早期RMCs凋亡有无作用，尚不清楚。

本研究通过建立体外培养的 RMCs高糖模型，观察高糖和RSV对miR-29b、SP1表达和RMCs凋亡的影响。本研究旨在揭示RSV防护DR早期病变的分子机制，为指导人们通过膳食途径防治DR提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料2013年1月至2015年12月，出生后3～5 d的Sprague Dawley(SD)大鼠10只，由四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所提供;白藜芦醇、各种抗体、荧光定量PCR试剂、Western blot试剂及各种试剂盒购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 出生后3～5 d的新生SD大鼠，用750 ml/L酒精浸泡消毒同时麻醉，无菌条件下取眼球，双抗PBS漂洗数遍，小心剥离视网膜，加入5 g/L胰蛋白酶，37℃消化20～30 min，充分吹打，加入含200 ml/L血清的培养基终止消化，不锈钢网过滤，1000 r/min离心3～5 min，培养基重悬，离心，反复2次。去上清后加入含200 ml/L血清的培养基制细胞悬液，调细胞密度为3×108个/L，接种于25cm2培养瓶中。3d换培养基，9 d后，将培养瓶密封，放入恒温摇床，200 r/min摇24 h进行RMCs纯化。细胞形态一致后，1:2传代分瓶，第2/3代细胞用于实验。细胞传代后接种于预置盖玻片的24孔培养板中，24 h完全伸展后进行鉴定。用RMCs标志物谷氨酰胺合成酶GS、谷氨酸转运蛋白GLAST和波形蛋白 vimentin联合，免疫细胞荧光双标鉴定RMCs。

1.2.2 细胞鉴定 细胞爬片以40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS 漂洗5 min×3次，用含10 g/L BSA、5 ml/L TritonX-100的PBS缓冲液孵育30 min，同前漂洗后，用含50～100 ml/L正常羊血清的PBS缓冲液孵育10 min，加1:2000稀释的 Anti-GS和Anti-GLAST，4℃过夜(同时设PBS替代一抗的空白对照和正常羊血清替代一抗的替代对照)，PBS漂洗后与罗丹明标记的荧光二抗37℃孵育30 min，PBS漂洗后加1 ∶200稀释的 Anti-vimentin，37℃，2 h，PBS漂洗后与FITC标记的荧光二抗37℃孵育30 min，PBS漂洗后加Hoechst于37℃孵育5 min，PBS缓冲液漂洗后，900 ml/L甘油封片，激光共聚焦显微镜观察照相。第3代的RMCs用于试验。

1.2.3 高糖模型建立及实验分组 高糖模型建立参照我们以往方法［3-5］，待细胞达80%融合时，弃掉含血清的培养液，换无血清的培养液培养24 h后，再换成含不同浓度葡萄糖的培养液，分别为:5、10、15、20、25、30、35、40 mM，通过 12、24、36、48、72 h 观察后，确立RMCs高糖模型的最适葡萄糖浓度为25 mM。实验分10组，分别是:正常对照组(CON)(普通培养基培养的细胞，不含葡萄糖和RSV);10、20、30 mM RSV干预正常对照组(CON+10 mM RSV，CON+20 mM RSV，CON+30 mM RSV);高糖组(HG)(25 mM葡萄糖的培养基培养的细胞);10、20、30 mM RSV 干预高糖组(HG+10 mM RSV，HG+20 mM RSV，HG+30 mM RSV)以及甘露醇高渗对照组(CON+mannitol，HG+mannitol)。

1.2.4 MiR-29b类似物和miR-29b抑制剂转染细胞 根据miR-29b序列合成miR-29b抑制剂和miR-29b类似物，然后转染入细胞。取对数期细胞，待细胞融合至80%后进行转染，将0.4 μg质粒DNA加入50 μl无血清培养基中(动作轻柔)。再把2 μl lipofectamine TM 2000 脂质体稀释至 50 μl，室温放置5 min，二者轻轻混合，室温放置20 min。吸出培养板中原液，轻柔加入配制好的含质粒DNA和脂质体复合物的转染培养基，总体积500 μl。放置于饱和湿度，37℃，5%CO2孵箱孵育4～6 h，再换新鲜培养基培养24 h。

1.2.5 QRT-PCR检测miR-29b和SP1 mRNA表达采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测微小RNA-29b(miR-29b)和特异蛋白1(SP1)基因表达，分别设计微小RNA-29b(miR-29b)和特异蛋白1(SP1)基因引物以及TaqMan荧光探针(由大连宝生物公司合成)。引物序列为:微小RNA-29b(miR-29b):5'-CGTAGCACCATTTGAAATCAGTGTT-3'，5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';特异蛋白 1(SP1):5'-AGG TGC ACC AGC TTC CAG GCC TG-3'，5'-CCA GGT CCA TGA AGG CCA AGT TG-3';核糖体蛋白L13 A(RPL13 A):5'-AAGCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC-3'，5'-TGTTTCCGTAGCCTCATGAGC-3'。 用常规酚/氯仿法提取大鼠 RMCs的 mRNA，进行qPCR 反应，反应体系 25 μl:2×TaqMan University PCR 混合液 12.5 μl，10 μmol/L 正反向引物各 0.5 μl，10 μmol/L TaqMan 探 针 0.3 μl，100 ng/ μl DNA0.2 μl，同时设立内对照核糖体蛋白 L13 A(RPL13 A)基因，反应在ABI Prism 7000荧光定量PCR仪上进行。反应条件为:93°C 2 min，93°C 1 min，55°C 1 min，共40个循环。采用低循环数(Ct)比较法计算目的基因的相对拷贝数与表达量。

1.2.6 Western blot检测特异蛋白1(SP1)蛋白表达 常规提取细胞总蛋白，Lowry法利用核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，各取蛋白样品30 μg上样，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转移至PVDF膜，1%BSA的TBST封闭，加相应各抗体4℃孵育过夜;加1∶20稀释SP-9002试剂盒中的二抗及三抗孵育，37℃振摇1 h;DAB避光显色3～5 min，至理想条带出现，对PVDF膜扫描存盘。

1.2.7 Annexin V/PI双标记法凋亡检测细胞凋亡以Annexin V/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡，细胞处理后，用4℃预冷的 PBS洗细胞2次，再用250 μl稀释的binding缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为1×106/ml，取 100 μl的细胞悬液于 5 ml流式管中，加 5 μl Annexin V/FITC 溶液和 10 μl 20 μg/ml的 PI溶液，混匀后于室温避光放置15 min，在反应管中加400 μl PBS，流式细胞仪上机检测。

1.3 统计学方法统计分析采用SPSS 19.0软件。计量资料采用均数±标准差表示，两组数据间的比较采用独立样本t检验，多组数据间的比较采用单因素方差分析，相关性用双变量分析，计数资料采用χ2检验，Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SD大鼠RMCs体外原代培养及鉴定取出生3～5天的新生SD大鼠视网膜进行原代视网膜细胞培养，培养9天后后，细胞达80%以上融合，胞体呈长纤维形，胞浆丰富，胞膜清晰，单核或多核，核呈椭圆形，位于细胞中央，整个视野可见典型的神经细胞、RMCs和神经节细胞，此时可进行RMCs纯化培养。纯化24 h后，细胞分布均匀，形态基本一致，生长情况良好，可见清晰的长梭形RMCs。以RMCs特征性标志物GS、Vimentin和GLAST对细胞进行鉴定，Hoechst 33342复染核，观察发现98%以上的细胞三种抗体染色呈阳性(图1)。

图1 谷氨酰胺合成酶、谷氨酸转运蛋白及波形蛋白联合鉴定大鼠视网膜muller细胞 a:谷氨酰胺合成酶鉴定大鼠视网膜 muller细胞;b:波形蛋白鉴定大鼠视网膜muller细胞;c:Hoechst 33342复染核;d:谷氨酰胺合成酶、波形蛋白及Hoechst 33342联合鉴定大鼠视网膜muller细胞;e:谷氨酸转运蛋白鉴定大鼠视网膜muller细胞;f:Hoechst 33342复染核;g:谷氨酸转运蛋白联合Hoechst 33342鉴定大鼠视网膜 muller细胞

2.2 RSV对高糖培养的大鼠RMCs miR-29b表达的影响qRT-PCR结果显示，与正常对照组(CON)相比，25 mM高糖培养组(HG)RMCs中miR-29b mRNA表达量明显降低(P＜0.05)，10、20和30 mM RSV(HG+10 mM RSV，HG+20 mM RSV，HG+30 mM RSV)干预明显增加高糖组(HG)miR-29b mRNA表达量，呈剂量依赖关系，10、20和30 mM RSV(HG+10 mM RSV，HG+20 mM RSV，HG+30 mM RSV)干预高糖组miR-29b mRNA表达量分别比未干预组增加了2.4倍、3.3倍和3.4倍(P＜0.05)。10、20和30 mM RSV干预对正常组(CON+10 mM RSV，CON+20 mM RSV，CON+30 mM RSV)对miR-29b mRNA表达量无明显影响(P＞0.05)。甘露醇高渗对照对miR-29b mRNA表达量无明显影响(P＞ 0.05)，见图2。

2.3 RSV对高糖培养的大鼠RMCs SP1表达的影响高糖培养RMCs 72小时后，SP1 mRNA表达量明显增加，10、20和30 mM RSV干预明显降低高糖组SP1 mRNA表达量(P＜0.05)。同样，高糖培养组(HG)SP1蛋白表达量也明显高于正常对照组(CON)(P ＜ 0.05)。10、20和 30 mM RSV(HG+10 mM RSV，HG+20 mM RSV，HG+30 mM RSV)干预明显降低高糖组(HG)SP1蛋白表达量(P＜0.05)。正常对照组(CON)SP1 mRNA和蛋白表达量与10、20和30 mM RSV干预正常对照组(CON+10 mM RSV，CON+20 mM RSV，CON+30 mM RSV)无明显差异(P＞0.05)。甘露醇高渗对照对SP1 mRNA和蛋白表达量无明显影响(P＞0.05)，见图3。

图2 白藜芦醇对大鼠视网膜muller细胞(RMCs)miR-29b mRNA表达的影响 与CON比较，＊＊＊P＜0.001;与HG比较，##P＜0.01，###P ＜0.001

2.4 RSV经调节miR-29b表达抑制高糖诱导的RMCs凋亡通过Annexin V/PI染色流式细胞分析发现，HG培养后，大鼠视网膜RMCs凋亡率明显高于正常对照组(CON)，20 mM RSV(HG+20 mMRSV)干预可明显降低HG组RMCs凋亡率。为了研究miR-29b在RSV抗凋亡中的作用，我们预先在细胞中转染了miR-29b类似物和miR-29b抑制剂，如图4所示，当细胞中转染了miR-29b抑制剂时，RSV抗高糖诱导的RMCs凋亡作用被逆转;当细胞中转染了miR-29b类似物后，RSV抗凋亡作用增加，表明RSV可能通过miR-29b发挥抗高糖诱导的RMCs凋亡。

图3 白藜芦醇对大鼠视网膜muller细胞(RMCs)SP1 mRNA和蛋白表达的影响 a:QRT-PCR检测大鼠视网膜 muller细胞(RMCs)SP1 mRNA表达量;b:Western blot检测大鼠视网膜muller细胞(RMCs)SP1蛋白表达量(代表图像);c:SP1与GAPDH蛋白表达量相对密度比值，与CON比较，＊＊＊P＜0.001;与HG比较，##P ＜0.01，###P ＜0.001

图4 白藜芦醇通过调节miR-29b表达抑制高糖诱导的大鼠视网膜muller细胞凋亡 a:Annexin V/PI双标流式细胞技术检测细胞凋亡(代表图像);b:大鼠视网膜 muller细胞凋亡比率 与CON比较，＊＊＊P＜0.001，###P＜0.001＆P＜0.05，与HG+20mM RSV比较，＆＆＆P＜0.001 versus

3 讨论

糖尿病发展成DR是一个缓慢的过程，一般需要5～6年的时间。糖尿病明确诊断、眼底出现改变之前的阶段被称作DR的临床前期。研究发现，DR的临床前期是先有视网膜神经的损害，然后才是组织学或是检眼镜下可见的血管异常［1，3-5］。我们前期研究也证实，DR早期RMCs结构和功能均发生异常改变，主要表现为胶质反应性增生、谷氨酸代谢异常、血管内皮细胞生长因子(VEGF)上调表达及RMCs凋亡。通过抑制DR早期RMCs损伤，将能阻止 DR 微血管病变，从而避免致盲［3～5］。

目前，国内外关于DR防护的研究不胜枚举，多数研究证明，高级糖基化终产物抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、肾素-血管紧张素系统抑制剂及一些抗氧化剂等对DR有防护效应，但对DR早期视损伤防护效果不明显［7～9］。我们采用抗氧剂牛磺酸对DR早期RMCs损伤干预后发现，低浓度的牛磺酸干预对RMCs损伤基本没有防护效应，高浓度牛磺酸干预对RMCs损伤虽有一定防护效应，但牛磺酸干预后DR早期患者视功能改善情况并不理想［4］。可能存在以下两个原因:①作用效力不够;②作用时间滞后。因而寻找更有效、更早期的抗RMCs损伤的DR早期防治措施十分必要。

本研究我们通过体外建立RMCs高糖模型，通过不同剂量RSV干预发现，高糖培养后，miR-29b和SP1表达明显改变，RMCs凋亡率明显增加，RSV干预可明显抑制高糖诱导的miR-29b和SP1异常表达和RMCs凋亡。通过预先在细胞中转染了miR-29b类似物和miR-29b抑制剂发现，RSV抑制凋亡作用受明显影响，初步提示RSV通过miR-29b发挥抗糖尿病早期视损伤作用。

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Resveratrol inhibits the apoptosis of rats retinal muller cells induced by high glucose via regulating miRNA-29b expression

ZENG Kai-hong1，2，WANG Yuan2，DENG Bo1，YU Xue-mei1，SONG Yi1，ZHOU Xue1，HUANG Lu-jiao1(1．Department of Clinical Nutrition，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，China．2．School of Medicine，Chengdu University of E-lectronic Science and Technology，Chengdu 610054，China)

Objective To investigate the molecular mechanisms of protecting early diabetic retinopathy by resvertrol(RSV)．MethodsThe effects of RSV on expressions of miRNA-29b(miR-29b)and specificity protein 1(SP1)as well as apoptosis of retinal muller cells(RMCs)were investigated through development of rat RMCs hyperglucose model in vito，and mothods of immunofluorescence，qRT-PCR，western blot and Annexin V/PI flow-cytometry．ResultsHigh glucose induced down-regulation of miR-29b and upregulation of SP1 and increased the apoptosis of RMCs．The effects could be reversed by RSV in vitro．Moreover，the anti-apoptosis effect of RSV could be reversed by transfection of miR-29b analogues to RMCs and miR-29b inhibitor(P ＜ 0.05)．ConclusionResveratrol can inhibit diabetic retinopathy in early stage by regulation of miR-29b expression．

Resveratrol;miRNA-29b;Specificity protein 1;Diabetic retinopathy;Apoptosis

Q5

A

1672-6170(2017)04-0022-05

2017-03-12;

2017-05-31)

国家自然科学基金项目资助(编号:81202206);四川省卫生计生委项目资助(编号:150216)