四物合剂通过TGF-β3蛋白通路干预顺铂作用颗粒细胞E2分泌机制的研究＊

蔡欣悦，赵丕文，唐炳华，杨晓敏，武洪波，崔丽霞，孙丽萍

（北京中医药大学生命科学学院北京100029）

四物合剂通过TGF-β3蛋白通路干预顺铂作用颗粒细胞E2分泌机制的研究＊

蔡欣悦，赵丕文，唐炳华，杨晓敏，武洪波，崔丽霞，孙丽萍＊＊

（北京中医药大学生命科学学院北京100029）

目的：通过细胞实验，以顺铂（Cisplatin，CDDP）作为颗粒细胞损伤因素，观察四物合剂对损伤后颗粒细胞分泌E2分泌水平及其合成关键酶CYP19a1基因表达水平的干预情况。方法：取SD大鼠卵巢颗粒细胞，经顺铂作用后给予四物合剂药理血清干预，对不同条件下上清液E2及E2合成关键酶CYP19a1表达水平进行测定。结果：放免法检测四物合剂药理血清干预细胞组E2水平与顺铂组相比明显提升，且加入TGF-β3蛋白通路阻断剂后E2下降；免疫组化和蛋白印迹结果显示四物合剂药理血清组CYP19a1蛋白表达水平高于顺铂作用组，在蛋白印迹检测中，阻断剂组较未加阻断剂组明显降低。结论：四物合剂药理血清能调节顺铂作用后的颗粒细胞E2分泌水平，其作用机制可能与通过TGF-β3蛋白通路增强CYP19a1表达有关。

四物合剂芳香化酶TGF-β3蛋白通路颗粒细胞雌激素

四物汤由熟地、当归、川白芍、川芎组成，原方用于治疗外伤，肠内有瘀血的病症。后世医家多用来治疗血虚、血瘀及出血所致的各种妇科杂病，效果显著[1]。现代关于四物汤的药理学研究显示，其组方成分在治疗贫血、提高免疫力、子宫双向调节上都有一定的作用[2]。孙海芸等[3]的实验结果表明，四物汤及其中成药四物合剂对颗粒细胞的凋亡有调整作用，但不能证明有完全修复作用[4-7]。颗粒细胞是参与卵巢功能维持的重要生殖细胞，其数量及分泌雌激素和孕激素的作用与卵泡发育密切有关系，四物汤调控妇科疾病的机制可能与此有关。同时也有研究发现，四物汤能够促进卵巢颗粒细胞增殖[8]。E2合成原料为胆固醇，经转运至线粒体后再由一系列酶催化转化为E2，在这一过程中P450芳香化酶（Aromatase，CYP19a1）是雌激素生成的限速酶。在卵巢颗粒细胞中，经CYP19a1催化，雄激素转化为雌激素。TGF-β3受体主要依靠Smad蛋白进行信号转导，已有文献提出TGF-β3-Smad3信号转导通路干预颗粒细胞分泌E2的水平[9]。本文通过细胞实验探讨四物合剂药理血清通过TGF-β3信号蛋白转导通路干预顺铂作用颗粒细胞分泌E2分泌水平的效果，以及其可能的机制。

1 材料

1.1 实验动物

选取健康22-24天雌性SD大鼠，体重50±10 g，动物分笼饲养在23-25℃室内,自然光照，正常喂养。动物饲料均购于斯贝福（北京）实验动物科技有限公司。

1.2 实验用药

四物合剂，100 mL/瓶（吉泰安药业有限公司，批号：0703014）；顺铂注射液，10 mg/支（济南齐鲁制药，批号：611048CF）；戊酸雌二醇片，1 mg/片（拜耳医药有限公司，批号：195A5）。

1.3 主要试剂

澳洲胎牛血清（美国Hyclone公司，批号：1300510）；DMEM/F12培养基（英国GE医疗生命科学公司，批号：AB216498）；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20160627、20160307、S1051、S1052）；蛋白相对分子质量Marker（美国Thermo公司，批号：00332484）；ECL超敏发光液（北京普利莱基因技术有限公司，批号：P1010）；芳香化酶兔源一抗（美国Santa Cruz公司，批号：sc30086）；二抗Anti-Rabbit（普利莱基因技术有限公司，批号：C1309）；DAB显色剂（北京中山金桥生物技术有限公司，批号：20151016）。

1.4 实验仪器

MC0-18AIC型CO2培养箱（日本SANYO公司）；LG16-WA型离心机（北京京立离心机有限公司），TS100型倒置显微镜（日本NIKON公司）；LX-800型酶联免疫检测仪（日本Epson公司）；5500型凝胶成像分析仪（美国FLUORCHEM公司）。

2 方法

2.1 卵巢颗粒细胞原代培养[10]

22-24天雌性SD大鼠6只，适应性喂养1天后每只给予注射孕马血清促性腺激素（Pregnant Mare Se⁃rum Gonadotropin，PMSG），48 h后断颈处死，浸入75%酒精消毒3 min，超净台内取双侧卵巢用预冷的hankƳs液中清洗3次。放入2.7 mL不含血清的培养基中，生物放大镜下用一次性1 mL注射器针头刺破卵巢，每个卵巢穿刺5 min，释放颗粒细胞。加入胰酶0.3 mL，吸管吹打悬液数次，培养箱中消化10 min，每隔3 min震荡一次。用含血清培养液终止胰酶消化并静置10 min，取悬液1 000 rpm，离心10 min，去掉上清液，hankƳ s液吹匀细胞，1 000 rpm，10 min再离心一次。弃上清，加入0.1 mL10%胎牛血清培养液，取10 uL置血球计数板在倒置显微镜下观察颗粒细胞并计数。稀释至5× 105，置培养瓶中培养或接种于96孔板。

2.2 药理血清制备[11]

选用22-24天雌性SD大鼠，体重约50 g，随机分为正常生理组，雌激素组，四物合剂组，适应性喂养1天后分别给予生理盐水、雌二醇（6µg/天）、四物合剂（0.63 mL/天）连续灌胃3天，于第4天灌胃后2 h取血清。

2.3 顺铂处理及药物干预[12]

细胞常规培养11天后，将培养基吸出，加入顺铂培养基（使其终浓度为2.5 μg·mL-1）刺激细胞；顺铂刺激12 h后，吸去培养基，每孔加入相应的药理血清（正常、雌激素、四物合剂），干预24 h，进行指标测定。

2.4 蛋白印迹实验步骤

用预冷的缓冲液清洗细胞后，加入RIPA裂解液（每106个细胞加200 μL）待细胞完全裂解后，刮下细胞碎片收集至离心管，12 000 rpm 5 min离心，取上清。BCA试剂盒测定样本的蛋白浓度后将蛋白质样品与4倍样品缓冲液（15 μL＋5 μL），EP管中混合后100℃加热5 min，蛋白变性后稳压200 V电泳45 min-1 h。PVDF转膜后置于5%的脱脂奶粉制备的封闭液中，室温下摇床1.5 h封闭。5%脱脂奶粉稀释一抗，一抗稀释液封闭4℃孵育过夜。待第二天一抗孵育结束，PBST冲洗膜3次，按照说明书浓度稀释二抗，二抗稀释液中室温摇床1 h。PBST清洗三次之后进行显影、定影、曝光和扫描，Image J分析条带灰度值。

2.5 免疫组化

4%多聚甲醛固定，PBS清洗3次后80 μL0.5%tri⁃tox-100室温孵育20 min，PBS清洗、3%H2O2去离子水孵育10 min，PBS清洗、滴加试剂A（封闭工作液）室温孵育10-15 min，倾去，滴加CYP19a1一抗（1：100），37℃孵育3 h，PBS清洗、滴加试剂B（二抗工作液IgG/ Bio），室温10-15 min，PBS清洗、滴加试剂C（辣根酶标记链霉卵白素工作液S-A/HRP）室温孵育，PBS清洗后使用DAB显色法显色。每孔随机选取6个视野，200倍和100倍放大拍照，利用Image J检测细胞中阳性反应颗粒的平均光密度（AverageOptical Density，AOD）。

2.6 统计学方法

采用SAS 9.4对各组间细胞上清液的E2水平、CYP19a1的表达含量作统计分析，结果均为平均值±标准差（）表示，采用one-way ANOVA和DunnettƳs t检验两两比较进行统计处理，以P<0.05作为检测标准。

3 结果

3.1 四物合剂药理血清对顺铂作用颗粒细胞E2水平分泌的干预效果

放免法测定细胞培养过程中上清液E2水平，结果显示雌激素药理血清组水平最高，顺铂作用组最低，且低于四物合剂组和正常生理组（图1），提示四物合剂药理血清可以改善颗粒细胞E2分泌能力。

图1 四物合剂药理血清对CDDP损伤大鼠卵巢颗粒细胞E2分泌水平的影响

3.2 四物合剂药理血清通过调节CYP19a1表达干预顺铂作用颗粒细胞E2水平分泌

免疫组化检测结果显示，各组颗粒细胞中CYP19a1蛋白在胞质中均有表达。由图2（A）可见生理对照组中棕黄色阳性染色最多，且颜色较深；其次为雌激素组，四物合剂组表达程度略低于阳性组，顺铂作用组蛋白表达最低，阳性细胞数量最少。利用Image J对各组图片进行分析，图2（B）结果显示顺铂作用组较生理组相比，阳性反应颗粒的AOD明显降低，经四物合剂药理血清干预后有所上升。Western Blot进行验证，结果显示顺铂作用颗粒细胞与生理对照组相比CYP19a1蛋白表达水平显下降，四物合剂药理血清干预后上升图2（C），与之前实验结果趋势相同。

图2 四物合剂药理血清对CDDP损伤大鼠卵巢颗粒细胞CYP19a1蛋白表达水平的影响

3.3 四物合剂药理血清通过TGF-β3调节CYP19a1表达

放免检测（图3）、Western Blot检测（图4）结果分别显示，加Smad蛋白通路阻断剂SB431542后，四物合剂药理血清干预顺铂作用的颗粒细胞E2分泌水平下降、CYP19a1蛋白表达降低，提示四物合剂药理血清可能通过TGF-β3蛋白通路调节CYP19a1表达而影响E2分泌。

图3 TGF-β3蛋白通路对四物合剂药理血清干预顺铂作用颗粒细胞E2分泌的影响

图4 TGF-β3蛋白通路对四物合剂药理血清干预顺铂作用颗粒细胞颗粒细胞CYP19a1表达的影响

4 讨论

E2合成原料为胆固醇，在类固醇激素快速合成调节蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）作用下转运至线粒体，经一系列酶催化转化为E2，此过程中CYP19a1是E2生成的限速酶。TGF-β3超因子家族[13]包括多种结构保守但是功能多样的因子，信号转导过程主要依靠Smad蛋白进行[14]。迄今为止，总共发现的TGF-β3异构体在哺乳动物卵巢中存在，但其功能不完全相同。已有研究表示，TGF-β3主要定位于颗粒细胞上，其mRNA含量随着卵泡直径的增大而升高[15]，表明其在腔前卵泡和早期有腔卵泡中起重要作用，其中之一就是各种类固醇激素的产生和分泌，如E2。顺铂对卵巢性激素的分泌和颗粒细胞、卵泡膜内层细胞的功能均有损伤，通过改变卵巢组织的稳态内环境，使其产生严重的氧化损伤。已有动物实验证明，顺铂作用于大鼠建立的卵巢早衰模型，其大鼠血清E2降低,卵泡数减少，闭锁卵泡增加[16]。本实验通过观察四物合剂药理血清干预顺铂作用的卵巢颗粒细胞E2水平与顺铂模型组相比明显上升。值得注意的是，TGF-β3能够在小鼠颗粒细胞中以剂量依赖的方式显著的促进E2的分泌，此效应通过增强E2合成中的关键限速酶CYP19a1的表达而实现[17-19]。在实验过程中加入外源性TGF-β3细胞因子和（或）Smad蛋白的阻断剂SB431542，观察四物合剂药理血清干预顺铂作用颗粒细胞E2分泌水平的变化，结果显示加入阻断剂组明显低于未加入阻断剂组。这一结果说明，在四物合剂药理血清干预顺铂作用颗粒细胞E2分泌过程中，很有可能通过TGF-β3-Smad3信号转导通路起作用。

CYP19a1是E2生成的限速酶，已有研究证实，TGF-β3能够通过Smad途径促进CYP19a1的表达来促进E2分泌，而这一过程是通过增强CYP19a1的转录而实现的[20]。而本实验结果显示，四物合剂药理血清通过TGF-β3干预顺铂作用颗粒细胞E2分泌。免疫组化和Western Blot检测结果显示顺铂作用颗粒细胞与生理对照组相比CYP19a1蛋白表达水平显下降，四物合剂药理血清干预后上升，同时在Western Blot检测结果中加入阻断剂SB431542后，四物合剂药理血清干预CYP19a1的蛋白表达水平与未加入阻断剂组有明显差异。

综上所诉，四物合剂药理血清能调节顺铂作用颗粒细胞E2分泌水平，其作用机制可能与通过TGF-β3蛋白通路增强CYP19a1表达有关。该结果为四物合剂应用治疗卵巢功能相关疾病提供了实验依据，接下来的实验中，我们将进一步探索四物合剂通过TGF-β3-Smad蛋白通路调节卵巢颗粒细胞功能的机制，为中医药改善卵巢功能，特别是治疗卵巢早衰提供实验依据。

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Effects of Si-Wu Mixture on Ovarian Granulose Cell Treated with Cisplatin through TGF-β3 Protein Pathway

Cai Xinyue,Zhao Piwen,Tang Binghua,Yang Xiaomin,Wu Hongbo,Cui Lixia,Sun Liping
(School of Life Sciences,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

This study was aimed to investigate the effects of Si-Wu mixture on the secretion of E2and the expression of CYP19a1 gene in granulosa cells after cell injury.Ovarian granulosa cells of SD rats were treated with cisplatin(CDDP). And the expression levels of E2and CYP19a1 were determined by different testing methods.The results showed that the level of E2induced by radioimmunoassay of the Si-Wu group was significantly higher than that of the CDDP group. Meanwhile,the group which added TGF-β3 protein pathway blocker was lower than others.The results of immunohistochemistry and western blotting showed that the expression level of CYP19a1 of the Si-Wu group was higher than that of the CDDP group.In the western blotting,the group which added blocker was significantly lower than the non-blocking group.It was concluded that the pharmacological serum of Si-Wu mixture can enhance the level of E2in CDDP cells through TGF-β3 protein pathway.And the effect is accomplished by the intervention of CYP19a1.

Si-Wu mixture,CYP19a1,TGF-β3 protein pathway,granulosa cells,estrogen

10.11842/wst.2017.04.017

R285.5

A

（责任编辑：陈宁，责任译审：王晶）

2017-02-20

修回日期：2017-03-19

＊国家自然科学基金委面上项目（81673764）基于ERαERβGPER介导分子通路探究四物汤补血调经的最佳配比规律及分子机制负责人：赵丕

文；北京中医药大学基本科研业务费（2015 JYB JSMS016）SF-1介导的四物合剂干预顺铂作用颗粒细胞E2分泌水平的研究，负责人：孙丽萍。

＊＊通讯作者：孙丽萍，副教授，硕士生导师，主要研究方向：分子生物学与中医药防治女性生殖疾病研究。