羧甲基壳聚糖纳米胶束的制备与光响应性研究

张 玲， 刘 娜， 向 锐， 朱翠婷， 刘雅嘉， 易 英， 殷以华

(武汉理工大学 化学化工与生命科学学院， 武汉 430070)

羧甲基壳聚糖纳米胶束的制备与光响应性研究

张 玲， 刘 娜， 向 锐， 朱翠婷， 刘雅嘉， 易 英， 殷以华*

(武汉理工大学 化学化工与生命科学学院， 武汉 430070)

智能响应性聚合物胶束作为药物控释传递系统的载体引起广泛关注，其中光刺激因为可控性高、清洁高效等优点被广泛研究.该文以丁二酸酐为连接臂将1-芘甲醇(PyM)接枝到羧甲基壳聚糖(CMCS)的氨基上制得两亲性大分子(PMS-g-CMCS)，然后在水溶液中自组装成光响应纳米胶束.采用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)表征胶束的大小和形态，并研究光刺激前后胶束的大小变化；通过核磁和荧光研究胶束的光响应机制.结果表明该胶束为类球形核-壳结构，粒径约200 nm，且具有较好储存稳定性；在紫外(UV)光照下，能发生结构改变，其光响应机制可归因于连接PyM的酯键断裂.胶束显示出可用作疏水性药物或农药光控释放载体的潜力.

羧甲基壳聚糖； 光响应； 纳米胶束

1实验部分

1.1试剂和仪器

试剂：羧甲基壳聚糖(CMCS，Mη=5.0×105Da，脱乙酰度为93.0%)，按报道[8]的方法制备，电位滴定法测得其羧甲基取代度为0.87.琥珀酸酐，1-芘甲醇(PyM)和尼罗红购买于Acros Organics，使用前均未经纯化处理.其他分析级试剂购于国药集团化学试剂公司.

仪器：傅立叶变换红外光谱仪(Nexus)、核磁共振波谱仪(AVANCEIII型)、透射电子显微镜(TEM，JSM-6700F)、动态光散射仪(Nano-ZS3600)和荧光光谱仪(QM-4).实验中使用的光源为UVA 340 nm(100W)的紫外光.

1.2光响应聚合物(PMS-g-CMCS)的制备

取1-芘甲醇(PyM)(0.60 mmol，139.4 mg)溶于氯仿(30 mL)，然后向该溶液中加入琥珀酸酐(0.78 mmol，78.1 mg)和4-(N， N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)(0.15 mmol，18.0 mg)，在55℃下搅拌回流反应20 h.反应完成后，用HCl溶液(1.0 mol·L-1)洗涤混合液以除去DMAP，然后用现配的饱和碳酸氢钠溶液萃取反应液，接着用乙醚洗涤水相以除去残余的氯仿，再加HCl(1.0 mol·L-1)酸化水相溶液至pH 4.0，此时有固体粉末析出，经过滤和真空干燥，得到产物1-芘甲基琥珀酸酯(PMS).取制得的PMS (33.2 mg，0.10 mmol)溶于DMSO(3.0 mL)中，分别加入EDC (23.0 mg，0.12 mmol)和NHS(11.5 mg，0.10 mmol)，活化2 h后，将反应液缓慢滴加到羧甲基壳聚糖水溶液(110.8 mg CMCS，15.0 mL H2O)中，于25℃条件下搅拌24 h.将反应液于去离子水中透析，旋蒸，冻干后得到光响应聚合物 (PMS-g-CMCS).上述所有步骤均避光操作.

改变1-芘甲基琥珀酸酯和CMCS的葡萄糖单元的投料比，根据上述方法，合成投料摩尔比为1∶7，1∶5和1∶3的样品，分别命名为PMS-g-CMCS-1，PMS-g-CMCS-2和PMS-g-CMCS-3.采用吸光光度法测得PMS的取代度分别为0.09，0.13和0.20.

“实际上，我并不理解为什么这些公司不愿在基因编辑产品上明确标识。”汉森说，“没有明确标识反而会使消费者疑心他们在隐藏某些东西，而且消费者对新产品的接受程度也取决于此。”

1.3光响应聚合物胶束的制备

取PMS-g-CMCS (10.0 mg) 溶于5.0 mL磷酸盐缓冲溶液(0.02 mol·L-1，pH 7.4)中，超声(60 W)3 min(开2 s，关2 s)，将所得溶液通过0.45 μm的微孔滤膜过滤得到胶束溶液.上述所有操作均在黑暗条件下进行.由PMS-g-CMCS-1，PMS-g-CMCS-2和PMS-g-CMCS-3制备的胶束样品分别命名为PM-1，PM-2和PM-3.

1.4胶束的表征

1.4.1临界胶束浓度(CMC)的测定 取等量尼罗红分别加入到0.003 0 mg·mL-1、0.005 0 mg·mL-1、0.007 0 mg·mL-1、0.010 0 mg·mL-1、0.050 0 mg·mL-1、0.100 0 mg·mL-1、0.200 0 mg·mL-1和0.400 0 mg·mL-1PMS-g-CMCS聚合物溶液中，使尼罗红的最终浓度均为1.0×10-5mol·L-1，然后采用荧光光谱仪依次测定其荧光发射光谱.

1.4.2形态、粒径与Zeta电位的测定 配制2 mg·mL-1pH为7.4的纳米胶束溶液滴加到置于滤纸上的铜片上，待其干燥后，用TEM观察聚合物胶束的形态结构；通过动态光散射仪(λ=512 nm，室温)检测聚合物胶束样品(PM-1、PM-2、PM-3)的粒径和Zeta电位.

1.5胶束的储存稳定性研究

将聚合物胶束样品溶解在PBS溶液(1.0 mol·L-1，pH 7.4)中，避光放置30 d，用动态光散射仪观察胶束粒径，电位以及分布的变化.

1.6胶束的光响应性研究

通过DLS和TEM观测胶束在光照前后的大小和形态变化来研究胶束的光响应性.以光照前的样品为对照，取10.0 mL胶束样品溶液(2.0 mg·mL-1)在25℃下用紫外光照射20 min，然后通过DLS和TEM测定溶液中胶束的粒径和形态变化.

通过1H NMR研究PMS-g-CMCS的光解机理.将PMS-g-CMCS-2溶于DMSO-d6/D2O(1∶3，V/V)，暴露于紫外光下20 min，然后用于1H NMR测量.使用荧光分光计来进一步研究胶束的光响应性：取溶解在pH 7.4 PBS中的PM-2(1.0 mg·mL-1)样品进行紫外光照处理20 min，测定光照前后的荧光强度.

2结果与讨论

2.1聚合物(PMS-g-CMCS)的合成和表征

图1显示了PMS-g-CMCS的合成路径.首先，PyM在DMAP催化下与丁二酸酐开环酯化制得PMS，然后该化合物在碳二亚胺催化作用下嫁接到CMCS的氨基上获得目标化合物PMS-g-CMCS.采用红外图谱表征了CMCS、PMS和PMS-g-CMCS的结构.从图2可看出，CMCS的主要特征谱带(曲线a)分别位于3 426 cm-1(O-H伸缩与N-H伸缩的重叠吸收)，2 930 cm-1(C-H伸缩)，1 600 cm-1(COO-伸缩振动与N-H弯曲振动的重叠)，1 420 cm-1(COO-拉伸)，1 117 cm-1(β(1→4)桥接O的拉伸)，1 339 cm-1(C-N拉伸).与CMCS相比，PMS-g-CMCS(见曲线c)在1 730 cm-1(酯基的C=O伸缩)和1 072 cm-1(酯基的C-O伸缩)的新吸收带以及观察到在1 522 cm-1处的吸收增加(N-H弯曲)，表明PMS成功地接枝在CMCS上.与PMS(见曲线b)相比，PMS-g-CMCS在1 286 cm-1处吸收强度降低和在1 072 cm-1处的吸收增加也证明了PMS-g-CMCS被成功合成.

图1 PMS-g-CMCS的合成路径Fig.1 Schematic illustration of the synthesis route of PMS-g-CMCS

(a)CMCS，(b)PMS，(c)PMS-g-CMCS图2 红外图谱Fig.2 FT-IR spectra

图3描述了CMCS、PMS和PMS-g-CMCS的1H NMR谱图.对于CMCS(见曲线a)，位于3.23～3.90 (H-2，3，4，5，6)处的信号峰归属于葡糖胺环上的质子，在2.10和4.52 处的特征峰分别归属于N-乙酰葡糖胺的CH3和羧甲基的CH2.对于PMS(见曲线b)，出现在8.38～8.10(m，9H)的特征峰归属于芘环质子，同时在5.86(s，2H)和2.68 (4H，CH2CH2)处的特征吸收峰对应于芘亚甲基质子和琥珀酸亚甲基质子.与曲线a相比，曲线c中出现在8.38～8.10 区域以及在5.8和2.46 处的新信号峰显示PMS成功地接枝到CMCS主链上.

a，CMCS；b，PMS；c，PMS-g-CMCS，溶剂DMSO-d6/D2O(1∶3，V/V )；d，光照20 min后PMS-g-CMCS，溶剂为 DMSO-d6/D2O (1∶3， V/V)图3 1H NMR图谱Fig.3 1H NMR spectra

2.2胶束的形成与表征

图4描述了两亲性PMS-g-CMCS形成胶束的过程，带有PMS侧基的疏水链段相互聚集形成内核，带有羧基的亲水链段向外伸展形成壳.图5显示了探针分子尼罗红在618 nm处的荧光强度对PMS-g-CMCS浓度的对数(logC)曲线图.3个胶束样品的CMC值分别为0.058 mg/mL，0.027 mg/mL和0.020 mg/mL，显示出CMC与PMS的取代度成反比：PMS取代度越高，CMC值越小，PMS-g-CMCS更易于在较低浓度形成纳米胶束.

图4 PMS-g-CMCS的自组装过程以及胶束的光解Fig.4 The assembly process of PMS-g-CMCS and the photolysis process of PMS-g-CMCS micelle

TEM观察也提供了胶束形成的直接证据.图6(a)显示胶束具有核-壳结构的类球形，且直径约为219.2±12.5 nm.

2.3胶束的储存稳定性

通过DLS测量胶束样品在pH7.4溶液中储存30 d后的平均粒径(MD)，分布系数(PDI)和Zeta电位来研究胶束的储存稳定性.如表1所示，所有样品在储存前后没有观察到MD和PDI值的显著变化，表明胶束具有高储存稳定性.这一结果可归因于PMS-g-CMCS侧链上芘基团之间的疏水相互作用和π-π堆积作用.这对于胶束到达目标位点之前避免药物泄漏具有重要意义.

图5 荧光强度与胶束PMS-g-CMCS-1 (◆)， PMS-g-CMCS-2(●) 和PMS-g-CMCS-3 (▲)浓度曲线Fig.5 Emission intensity of Nile red as a function of the concentrations of PMS-g-CMCS-1 (◆)， PMS-g-CMCS-2 (●)，and PMS-g-CMCS-3 (▲)

图6 PMS-g-CMCS胶束的透射电镜图(a)光照前和(b)光照后Fig.6 TEM images of the PMS-g-CMCS micelles (a) before and (b) after UV irradiation for 20 min

聚合物胶束储存前储存后粒径/nm分布系数电位/mV粒径/nm分布系数电位/mVPM-1302±16．20．133±0．06-25．8±1．10309±16．00．143±0．08-27．3±0．87PM-2228±12．70．127±0．03-29．0±0．65230±12．90．129±0．08-28．2±0．74PM-3190±12．40．131±0．08-28．0±0．13193±13．20．133±0．07-29．4±0．24

2.4胶束的光响应性

胶束的光响应性可通过DLS和TEM检测胶束光照前后粒径的变化来研究.光照前，采用DLS测量的各样品的粒径见表1.在UV光照射20 min后，各样品的粒径分别降低至110±11.8 nm，140±12.8 nm和150±13.2 nm，这意味光解导致了胶束结构的破坏.然而，由于在侧链中光解产生的羧基可以与CMCS主链上的胺基形成离子交联[9]，通过DLS检测到新的纳米聚集体.TEM也检测了胶束在UV光下的粒径大小变化.如图6(a)所示，基于PMS-g-CMCS-2的胶束在没有光照的情况下粒径为219±12.4 nm，相比之下，在UV照射20 min后其粒径减小到43.4±6.8 nm(图6(b)).光照前后的粒径差大于DLS检测到的结果，这可归因于TEM测试前的制样过程，胶束发生了收缩.

1H NMR证实PMS-g-CMCS的光解机制为芘甲醇酯键的断裂.如图3中的曲线c所示，由于PMS-g-CMCS在D2O/DMSO-d6(3∶1)中完全溶解，可清楚地观察到8.27～7.99处对应于芘基团的质子信号以及5.88 (2H，-CH2Pyrene)处连接芘基团的亚甲基质子信号.然而，当混合溶液在UV光下照射20 min时，5.88 的质子信号移动到5.47 (曲线d)，这正是光解生成的芘甲醇亚甲基的质子信号.

为了进一步证明胶束能响应UV刺激发生结构改变，研究了胶束中芘基团的荧光发射光谱.如图7所示，在UV照射之前，PM-2溶液在470 nm处显示出芘的准分子发射峰，表明芘基团的聚集和疏水核的形成.照射20 min后，准分子发射强度明显减弱，而归因于PyM单体在380～410 nm范围内的发射带强度增加，表明胶束疏水核的解聚，同时也进一步证实了由于光解芘甲氧基从PMS-g-CMCS分子链上脱落下来.

图7 PM-2在紫外光照前后的荧光光谱Fig.7 Fluorescence emission spectra of the PM-2 solution before and after UV light irradiation

3结论

本文通过将光响应基团接枝到羧甲基壳聚糖骨架上，再通过自组装得到纳米胶束.TEM观察显示胶束为约200 nm的核-壳结构，且分布均匀；荧光探针测定表明PMS-g-CMCS中光响应基团的取代度与临界胶束浓度呈反比；DLS研究表明胶束具有良好的储存稳定性.TEM、DLS研究表明胶束具有良好的光响应性，核磁和芘基团的荧光发射光谱研究证实其光响应性归因于连接芘甲氧基的酯键断裂.这些结果为该胶束用作疏水性药物或农药载体提供了理论依据.

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Preparation and study of photo-responsive nanomicelles based on carboxymethyl chitosan

ZHANG Ling， LIU Na， XIANG Rui， ZHU Cuiting， LIU Yajia， YI Ying， YIN Yihua

(School of Chemistry， Chemical Engineering and Life Science， Wuhan University of Technology， Wuhan 430070)

The intelligent response polymer micelles have attracted much attention as a carrier of drug controlled release system. Light stimulation is of great interest because of its advantages such as high controllability， clean and high efficiency. In this thesis， 1-pyrenemethyl succinate (PMS) was prepared by the esterification of 1-pyrenemethanol with succinic anhydride， which was grafted onto the carboxymethyl chitosan backbone to obtain photoresponsive polymer (PMS-g-CMCS)， which could self-assemble into light-responsive polymeric micelles in aqueous condition. The size and morphology of the micelles were characterized and their changes before and after light stimulation were studied by dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM). Their photoresponsive mechanism was also investigated by fluorescence and1H NMR. The results showed that the micelles are spherical-core structures with a diameter of about 200 nm and exhibiteded good storage stability. Under the UV light stimulus， the structure will be able to chang. The photoresponsive mechanism can be attributed to the breakage of ester bond linked to PyM. These properties of micelles show the potential for use as a light controlled release carrier of hydrophobic drug or pesticide.

carboxymethyl chitosan; photo responsiveness; nanomicelle

2017-03-11.

国家自然科学基金项目(51373130); 武汉理工大学本科生创新研究基金(2016-HS-B1-12)．

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.04.009

1000-1190(2017)04-0465-05

O636.9

A

*通讯联系人. E-mail: yihuayin@aliyun.com.