好氧污泥-微藻耦合颗粒的培养及特性研究

刘 琳,叶嘉琦,刘玉洪,2,黄 栩,刘超翔*(.中国科学院城市环境研究所,中国科学院城市污染物转化重点实验室,福建 厦门 3602；2.中国科学院大学,北京 00049)

好氧污泥-微藻耦合颗粒的培养及特性研究

刘 琳1,2*,叶嘉琦1,刘玉洪1,2,黄 栩1,刘超翔1*(1.中国科学院城市环境研究所,中国科学院城市污染物转化重点实验室,福建 厦门 361021；2.中国科学院大学,北京 100049)

研究以好氧颗粒污泥为生物载体、小球藻与栅藻为接种微藻,开展了菌藻耦合颗粒化系统构建与解析工作,并考察了选择压关键因子—沉降时间的作用影响.研究结果指出好氧污泥与微藻可形成稳定的耦合颗粒体,沉降时间会影响耦合进度,但其并非耦合实现的决定性因素.在稳态颗粒性质方面,沉降时间差异设定会显著影响耦合颗粒的沉降性能、氮素去除能力、粒径大小及生物柴油产量(P＜0.05),但耦合颗粒的微生物表面电荷、关键脂肪酸甲酯组分及磷素去除能力对其作用响应并不显著(P＞0.05).蓝藻和真核藻类在颗粒中所占比例约为5%和 95%,接种微藻在真核藻类群落中可保持主导地位(相对丰度＞98%),但不同沉降时间处置下小球藻和栅藻在颗粒体中相对优势性具有明显区别.

废水处理；生物质能源；菌藻共生；颗粒污泥；沉降时间

细菌与藻类对维持水环境中的物质循环与生态平衡具有重要作用,同时也被认为是替代石化能源的重要生物质原料[1-2].近年来,好氧颗粒污泥技术成为活性污泥工艺领域的研究热点与发展方向,以沉降时间为代表的选择压被认为在其启动过程中发挥着主导作用[3],而文献报道指出颗粒化结构中不单包括细菌和真菌等微生物,还可在有光条件下为藻类提供共生环境[4-5].因此,上述发现表明好氧颗粒污泥与功能性微藻具有耦合共生的可能性,在有效处理废水的同时,有望提高剩余污泥资源化价值与微藻回收效率.但是,目前针对该耦合颗粒体的培养过程调控及性质认定等还有待研究.基于此现状,本研究开展了此新型菌藻共生系统构建与解析工作,并考察了该系统对沉降时间的作用响应情况,以期为微生物颗粒技术体系进一步完善提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 接种微藻与颗粒污泥

实验微藻为小球藻(FACHB-31)和栅藻(FACHB-416),两者均采购于中国科学院水生生物研究所,微藻接种前采用 BG11培养基进行扩大培养,反应器中微藻的接种量约为 107cell/L.实验接种好氧颗粒污泥的悬浮浓度约为 2g/L,颗粒平均粒径为(0.63±0.04)mm.

1.2 运行条件设置

实验采用运行装置为 3组玻璃制成的序批式光照反应器,反应器有效体积为 2L,体积交换率设定为 75%.反应器设置在光照培养箱中进行操作,光照设置模拟日光条件(即 12h光周期),光照强度设定为(6000±200)lux,温度为(26±1)℃,富氧采用底端曝气方式,气量通过流量计控制在2L/min,pH值水平保持在7.2～7.7之间.废水处理运行设定在有光周期内进行,每日运行2周期,每周期6h,其中进水时间1min,排水时间2min,沉降时间分别为 2min(R1)、5min(R2)和 10min(R3),剩余周期内时间为曝气阶段.实验废水为自来水配制而成的模拟城市污水,水质主要成分及其平均含量为:生化需氧量(200mg/L)、氨氮(35mg/L)、磷酸盐(10mg/L)和碳酸氢钠(400mg/L).

1.3 分析项目和方法

实验中氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、总氮、磷酸盐及污泥体积指数等按照国家相关标准方法进行分析测定[6].耦合颗粒中藻类的富集程度通过叶绿素含量进行表征,颗粒测定前首先利用超纯水轻微清洗 3次,以降低悬浮吸附态藻类对分析的干扰,之后通过乙醇法提取叶绿素,叶绿素含量测定按照 Ritchie[7]所述方法进行操作,并以生物干重计量.颗粒经分散处理后,稳态耦合颗粒所含蓝藻比例与细胞表面电荷水平,分别通过PHYTO-PAM 浮游植物荧光仪(Heinz Walz, Effeltrich)和Zeta电位分析仪(MALVERN, ZEN 3600)进行测定.稳态菌藻耦合颗粒的平均粒径大小通过激光粒度仪(Malvern Mastersizer 2000)分析测定.实验采用 SPSS软件进行菌藻耦合颗粒性质差异显著性的统计分析(P＜0.05).

成熟耦合颗粒经冷冻干燥后用于后续资源化研究,生物质脂肪酸甲酯(FAMEs)制备采用原位酯交换反应方法[8],通过气相色谱-质谱联用仪(Agilent 7890A - 5975C)进行 FAMEs组分分析,FAMEs标准样品为 52种 C4～C24混合标样(GLC-674, Nu Chek Prep. Inc).色谱柱为安捷伦HP-5MS毛细管柱 (30m×250µm×0.25µm),色谱升温程序设定为:50℃恒温 2min;之后以 10℃/min升温速率提高到250℃,并保持20min.载气为高纯氮气,分流比为20:1,离子源温度保持200℃,扫描质量数范围为50～500amu.在耦合颗粒化系统稳定阶段(第40d),实验对其结构中真核藻类群落进行分析,DNA和PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行质量检测,引物对应区域为 18sV4区(528F-706R),使用 TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建,构建文库经 Qubit和 QPCR定量后,使用Illumina® HiSeq 2500平台进行高通量测序,之后测序数据经过拆分、拼接及过滤后,利用 Uparse软件对有效Tags进行聚类(默认值为97%),采用RDP Classifier方法与Silva数据库进行物种注释分析.

2 结果与讨论

2.1 菌藻耦合颗粒化的培养进程

藻类处理废水的研究过程中,叶绿素含量被普遍用于衡量其在系统中的生物量水平[9],因此,本研究以此指标对菌藻耦合进度与效果进行评估.实验结果指出在短暂耦合运行后,叶绿素在颗粒体中即可被显著检出[约为(0.1±0.03)mg/gSS],而在运行后期,不同耦合颗粒中叶绿素含量均显示出相对稳定的趋势[约为(5.27±0.17)mg/gSS].此结果表明藻类与好氧颗粒污泥可实现良好的耦合共生效果,但藻类在颗粒体结构中存在富集的平衡点,进而我们认为此平衡状态可作为确定该系统启动是否达到稳定阶段的假设依据.如图1所示,R1系统中颗粒所含叶绿素水平在第30d达到稳态,而R2和R3系统则发生在第25d,根据上述假设,此变化趋势指出沉降时间不是菌藻耦合颗粒形成的决定性因素,但较长的沉降时间有利于加快耦合颗粒培养进程.该规律与沉降时间对好氧污泥颗粒化过程的影响效果相反[3],归结原因是由于藻类的沉降速率较慢及成熟颗粒污泥的应用,较短沉降时间设定条件会降低接种微藻与好氧颗粒污泥耦合共生的生物量,从而延迟了耦合颗粒化系统的启动时长.

图1 耦合颗粒中叶绿素含量及组分比例的变化情况Fig.1 Change in concentrations and compositions of chlorophyll in algae-bacteria granular consortia

叶绿素a和叶绿素b为本实验所接种微藻的主要叶绿素构成组分[7],实验结果表明随着颗粒化进程,两者的含量比例也会发生显著上升.在初期阶段颗粒体中叶绿素a与叶绿素b的比例约为(0.65±0.01),而在稳态阶段R1～R3中平均比例分别为(3.38±0.06)、(3.25±0.09)和(3.22±0.07).关于叶绿素循环的综述文献报道指出植物从光照条件转变到避光条件后,由于光系统核心复合体应激调控,其叶绿素a与叶绿素b的比例会发生显著升高[10].因此,耦合颗粒体中叶绿素组分比例变化结果暗示随着藻类在颗粒体中富集含量增加,颗粒内层结构光供给不足现象将会发生,而在较短沉降时间设定条件下此现象将较为显著.

2.2 稳态菌藻耦合颗粒的物化性质

菌藻耦合颗粒达到稳态阶段后,实验对耦合颗粒性质进行了检测分析,各测定参数数据的平均值如表1和图2所示.实验结果指出耦合颗粒粒径大小及可表征微生物聚集体沉降性能的5min污泥体积指数(SVI5)在3组反应器中差异显著(P＜0.05),而较弱选择压导致的絮状生物体和细小颗粒在反应器中累积存留为引发此现象的主要原因[3],该结果表明较长沉降时间会影响耦合系统的颗粒化效果.Qin等[11]在研究沉降时间对好氧污泥颗粒化的作用中也发现,较长沉降时间下颗粒生长缓慢,并且粒径较小.然而,Zeta电位检测数据指出不同耦合颗粒的微生物表面电荷并未表现出显著差异(P＞0.05),即耦合体中微生物细胞间的静电斥力保持相似水平[12],从而表明沉降时间差异设定不会影响耦合体的聚集稳定性.

在生物质能源制备方面,实验结果指出在较短沉降时间设定条件下耦合颗粒的FAMEs产量会显著降低(P＜0.05),而本实验中R1系统较大的颗粒粒径对于颗粒内部光通量限制的增强,可能是导致其FAMEs较低产出的因素之一.周文广[13]等指出光照是藻类进行光合固碳的先决条件,而当其成为藻类培养过程的限制因素时,藻类固碳率与光转化效率成正比.尽管 FAMEs的产量有所差异,但是其主要构成组分的含量比例在不同选择压强度下具有相似性.不同 FAMEs产品中不饱和脂肪酸甲酯(52%～56%)所占比例皆略高于饱和脂肪酸甲酯(44%～48%);而棕榈酸甲酯(C16:0)为应用不同耦合颗粒制备的生物柴油的主要组成成分,其含量比例为24.79%～26.16%.通常,pH值、温度及气体传质等众多因素可影响藻类体内中性与极性脂质含量,还可影响细菌及真菌中脂肪酸成分形态[13-14].但棕榈酸甲酯被普遍发现是以活性污泥或藻类为原料制备的生物质柴油的主要成分[1,9,15-16],而饱和或不饱和FAMEs在生物柴油中所占比例与其制备方法具有紧密的相关性[17],因此微生物中主要脂肪酸成分的相似性及相同 FAMEs制备方法的应用,可能是本实验中FAMEs组分差异不大的主要原因.

表1 稳态菌藻耦合颗粒的性质参数Table 1 Characteristics of algae-bacteria granular consortia in the mature phase

图2 耦合颗粒的FAMEs组分(相对比例含量＞2%)Fig.2 Composition of FAMEs (relative proportion ＞ 2%) obtained from the different granular samples

2.3 菌藻耦合系统的水质净化效果

稳态菌藻耦合颗粒在不同选择压运行条件下的营养盐去除能力如图3所示.实验结果指出R1～R3中氨氮平均比降解速率分别为9.80、9.49和 9.44mg/gSS,而总氮平均比降解速率分别为3.80、3.75和 3.51mg/gSS,耦合颗粒系统单一周期内的氮素比降解速率在2min和10min沉降时间设定条件下差异显著(P＜0.05),较短沉降时间设定条件下的反应器展现出较高的氨氮降解能力和总氮去除能力.Gao等[18]综述指出粒径可成为颗粒结构内部溶解氧传导与基质扩散的主要限制因素,并决定好氧颗粒污泥的氮素硝化与反硝化作用区域面积,从而影响氮素去除效果.结合颗粒的性质分析结果,系统中氨氮去除情况不符合颗粒粒径大小对颗粒污泥的影响规律,分析原因有两点:(1)藻类的氮素生物吸收累积作用可使污泥系统内氨氮转化途径多元化[9,19],从而降低颗粒粒径对氨氧化过程的影响程度;(2)光照条件会显著抑制氨氧化菌和硝化细菌的生物活性[20],而 R1中耦合颗粒因具有较大粒径,可为其结构中脱氮细菌起到保护作用,从而提高氨氮降解效果.此外,Liu等[21]指出藻类在固定二氧化碳过程中所产生的有机代谢产物,可成为菌藻共生体系内反硝化异养菌的有效碳源,因此耦合颗粒中藻类分泌物可能是R1在具有较大反硝化区域基础上,另一个促进其总氮去除的影响因素.

图3 氮磷营养盐的周期比降解速率Fig.3 Specific removal rates in one cycle of ammonia nitrogen, total nitrogen and phosphate

在磷酸盐去除能力方面,R1～R3系统的平均比去除速率分别为1.16、1.17和1.17mg/gSS,沉降时间差异设定对耦合系统除磷效果的影响并不显著(P＞0.05).尽管,生物吸收利用与化学沉淀皆为微生物系统中磷酸盐的去除途径,但是在pH＜9条件下前者已被证明是絮状菌藻共生体系处理污水过程中磷酸盐的主导脱除方式,而细菌与藻类对磷酸盐的最大吸收能力分别取决于水质中碳磷比例和氮磷比例[22],因此本实验所用模拟城市污水的有机物与营养盐组分决定了不同耦合颗粒对磷酸盐去除的相似性.

2.4 稳态颗粒的藻类群落结构

好氧污泥与微藻耦合颗粒达到稳态阶段后,对其藻类构成进行检测分析,群落组成信息如表1和图 4所示.实验结果指出以蓝藻为代表的原核藻类在耦合颗粒中是普遍存在的,但其在藻类群落结构中所占相对丰度较低(约为 4%～5%),而沉降时间差异控制未对其富集比例具有显著影响(P＞0.05).众多相关研究也发现类似藻类竞争规律,文献报道指出在光照不足条件下,栅藻比蓝藻具有更快的氮素吸收利用速率,而小球藻会取代蓝藻成为光合微生物群落结构中优势物种[23].此外,Ramanan等[19]发现相比蓝藻,变形菌门和拟杆菌门更易于与绿藻形成共生关系,而此两种细菌群落已被证明在好氧颗粒污泥结构中占据主导地位[5,24].

微生物高通量测序分析结果指出实验所用的接种微藻可保持其在真核藻类结构中显著的优势地位,两者在不同耦合颗粒中所占相对丰度总和皆大于 98%.耦合颗粒中共生的其他藻类主要包括硅藻纲(Bacillariophyceae)所属的羽纹藻(Pinnularia)、细柱藻(Cylindrotheca)和茧形藻(Entomoneis),共球藻纲(Trebouxiophyceae)所属的索囊藻(Choricystis),及绿藻纲(Chlorophyceae)所属的环藻(Sphaeroplea).同时,测序分析结果也显示选择压差异控制可影响小球藻与栅藻在耦合颗粒中的相对丰度水平,在2min沉降时间条件下栅藻所占比例较高(约为 54%),而较长沉降时间设定条件下小球藻则具有显著优势(相对丰度约为80%).不同微藻与浮游动物间的相互作用关系可能与此现象相关.文献报道及本课题组前期研究证明好氧颗粒污泥结构及系统体系中存在原生动物共生现象[25],而小球藻和栅藻分别会以提高增长率和群体聚集方式来应对原生动物的摄食风险[26],从而在较弱选择压下小球藻具有富集优势,而在较强选择压下栅藻的群体效应则促使其与颗粒污泥形成更为稳定的共生关系.

图4 稳态耦合颗粒的真核藻类群落结构Fig.4 Taxonomic affiliation of eukaryotic algae in steady-state granular consortia

3 结论

3.1 废水处理过程中好氧颗粒污泥与典型功能性微藻,可在序批式光照反应器中形成稳定的耦合颗粒化共生体;藻类在颗粒体结构中存在富集的生物量平衡点,并会遇到光能供给不足的限制影响;接种微藻可在颗粒体藻类结构中保持显著的优势地位,而蓝藻相对丰度较低.

3.2 沉降时间在耦合颗粒形成过程中不起决定性作用,但其差异设定会显著影响稳态耦合颗粒的部分性质;尽管较长沉降时间设定可加快菌藻耦合进程与提高生物能源产量,但会降低系统的颗粒化效果与氮素营养盐去除能力;此外,高通量测序结果暗示耦合颗粒中微藻的种群优势性可实现定向调控,而沉降时间可作为备选控制条件.

[1] Kwon E E, Kim S, Jeon Y J, et al. Biodiesel production from sewage sludge: new paradigm for mining energy from municipal hazardous material [J]. Environmental Science & Technology, 2012,46(18):10222-10228.

[2] 熊 伟,黄 云,付 乾,等.微藻生物膜营养环境对微藻生长和油脂积累影响 [J]. 中国环境科学, 2016,36(8):2463-2469.

[3] Wastewater purification: aerobic granulation in sequencing batch reactors [M]. CRC Press, 2007:85-111.

[4] 隗启源,杨昌柱,濮文虹.藻类生长对好氧颗粒污泥的影响 [J].中国给水排水, 2013,29(9):29-32.

[5] Huang W, Li B, Zhang C, et al. Effect of algae growth on aerobic granulation and nutrients removal from synthetic wastewater by using sequencing batch reactors [J]. Bioresource Technology, 2015,179:187-192.

[6] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法 [M]. 4版.北京:中国环境科学出版社, 2002:46-213.

[7] Ritchie R J. Universal chlorophyll equations for estimating chlorophylls a, b, c, and d and total chlorophylls in natural assemblages of photosynthetic organisms using acetone, methanol, or ethanol solvents [J]. Photosynthetica, 2008,46(1):115-126.

[8] Revellame E, Hernandez R, French W, et al. Biodiesel from activated sludge through in situ transesterification [J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2010,85(5):614-620.

[9] Wang M, Yang H, Ergas S J, et al. A novel shortcut nitrogen removal process using an algal-bacterial consortium in a photo-sequencing batch reactor (PSBR) [J]. Water Research, 2015,87:38-48.

[10] Rüdiger W. Biosynthesis of chlorophyll b and the chlorophyll cycle [J]. Photosynthesis Research, 2002,74(2):187-193.

[11] Qin L, Liu Y, Tay J H. Effect of settling time on aerobic granulation in sequencing batch reactor [J]. Biochemical Engineering Journal, 2004,21(1):47-52.

[12] 王然登,程战利,彭永臻,等.强化生物除磷系统中胞外聚合物的特性 [J]. 中国环境科学, 2014,34(11):2838-2843.

[13] 周文广,阮榕生.微藻生物固碳技术进展和发展趋势 [J]. 中国科学:化学, 2014,44(1):63-78.

[14] 刘 波,孙 艳,刘永红,等.产油微生物油脂生物合成与代谢调控研究进展 [J]. 微生物学报, 2005,45(1):153-156.

[15] Mondala A, Liang K, Toghiani H, et al. Biodiesel production by in situ transesterification of municipal primary and secondary sludges [J]. Bioresource Technology, 2009,100(3):1203-1210.

[16] Zhu L, Wang Z, Shu Q, et al. Nutrient removal and biodiesel production by integration of freshwater algae cultivation with piggery wastewater treatment [J]. Water Research, 2013,47(13): 4294-4302.

[17] Georgianna D R, Mayfield S P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels [J]. Nature, 2012, 488(7411):329-335.

[18] Gao D, Liu L, Liang H, et al. Aerobic granular sludge: characterization, mechanism of granulation and application to wastewater treatment [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2011,31(2):137-152.

[19] Ramanan R, Kim B H, Cho D H, et al. Algae–bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications [J]. Biotechnology Advances, 2016,34(1):14-29.

[20] Kaplan D, Wilhelm R, Abeliovich A. Interdependent environmental factors controlling nitrification in waters [J]. Water Science and Technology, 2000,42(1/2):167-172.

[21] Liu H, Zhou Y, Xiao W, et al. Shifting nutrient-mediated interactions between algae and bacteria in a microcosm: evidence from alkaline phosphatase assay [J]. Microbiological Research, 2012,167(5):292-298.

[22] Su Y, Mennerich A, Urban B. Municipal wastewater treatment and biomass accumulation with a wastewater-born and settleable algal-bacterial culture [J]. Water Research, 2011,45(11):3351-3358.

[23] Hyenstrand P, Burkert U, Pettersson A, et al. Competition between the green alga Scenedesmus and the cyanobacterium Synechococcus under different modes of inorganic nitrogen supply [J]. Hydrobiologia, 2000,435(1-3):91-98.

[24] 侯爱月,李 军,王昌稳,等.不同好氧颗粒污泥中微生物群落结构特点 [J]. 中国环境科学, 2016,36(4):1136-1144.

[25] Liu L, You Q, Gibson V, et al. Treatment of swine wastewater in aerobic granular reactors: comparison of different seed granules as factors [J]. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2015,9(6):1139-1148.

[26] 杨 州,孔繁翔,史小丽,等.萼花臂尾轮虫培养滤液对铜绿微囊藻,斜生栅藻和小球藻群体形成及生长的影响 [J]. 应用生态学报, 2005,16(6):1138-1141.

Research on the development and properties of aerobic sludge-microalgae granular system.

LIU Lin1,2*, YE Jia-qi1, LIU Yu-hong1,2, HUANG Xu1, LIU Chao-xiang1*(1.Key Laboratory of Urban Pollutant Conversion, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China；2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China). China Environmental Science, 2017,37(7)：2536～2541

The effect of settling time on the development and properties of algae-bacteria granular consortia, which were cultivated with aerobic granules as biological carrier, and Chlorella and Scenedesmus as seed microalgae, were investigated in this research. The results indicated that the algae-bacteria granular consortia could be successfully developed based on the aerobic granules and targeted microalgae. Although settling time could affect the start-up duration of granular system, it was not the crucial factor for the culture of granular consortia. In terms of properties of the mature granular consortia, the settling time could significantly affect the settleability, nitrogen removal ability, granular size and biodiesel yield of the consortia granules (P＜0.05), while the obvious response of zeta potential, phosphate removal rate and the dominate compositions of fatty acid methyl esters in the biodiesel to the settling time was not observed in this experiment (P＞0.05). The relative abundance of cyanobacteria and eukaryotic algae in all granules were about 5% and 95%, respectively. The targeted microalgae maintained dominance in the eukaryotic algal community (relative abundance＞98%), and the comparative advantage of biomass between Chlorella and Scenedesmus in the granules was showed under the different condition of settling time in systems.

wastewater treatment；biomass energy；algal-bacterial consortia；granular sludge；settling time

X703.1

A

1000-6923(2017)07-2536-06

刘 琳(1984-),男,黑龙江七台河人,助理研究员,硕士,主要从事废水处理与资源化技术研究.发表论文50余篇.

2016-12-06

国家自然科学基金资助项目(51308523);厦门市科技计划项目(3502Z20162001);厦门理工学院创新项目(201611062288)

* 责任作者, 助理研究员, lliu@iue.ac.cn; 研究员, cxliu@iue.ac.cn