微小RNA-146a在新生隐球菌、格特隐球菌诱导THP-1细胞炎性反应中的机制研究

王 妍， 高 睿， 陈 宏， 陈 欢， 金 怡，廖宁馨， 陈江汉

微小RNA-146a在新生隐球菌、格特隐球菌诱导THP-1细胞炎性反应中的机制研究

王 妍1， 高 睿1， 陈 宏1， 陈 欢2， 金 怡1，廖宁馨1， 陈江汉1

目的 观察并分析微小RNA-146a （miR-146a）在新生隐球菌（标准株WM148）、格特隐球菌（标准株R265）刺激人单核巨噬细胞系（THP-1细胞）中表达的差异，探讨miR-146a在隐球菌所致隐球菌脑膜炎中的调控作用及机制。方法 体外培养的人单核巨噬细胞系THP-1细胞分成新生隐球菌诱导组、格特隐球菌诱导组，按灭活菌数∶THP-1=5∶1的比例与THP-1细胞共孵育0、3、6、9和12 h后离心收集上清液和细胞沉淀。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测各组细胞miR-146a的表达情况，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的释放量。结果 新生隐球菌诱导组细胞中miR-146a表达量与0 h相比明显升高（P＜0.01），且在3 h达到峰值，随后呈下降趋势；上清液中TNF-α 的表达量在诱导后12 h达到最高值，IL-6的表达各时间点没有明显变化。格特隐球菌诱导后，miR-146a的表达逐渐升高，12 h达到最高值，但3 h、6 h 点变化与0 h比较差异并无统计学意义；上清液中TNF-α的表达12 h到达峰值；IL-6的表达逐渐增加，12 h达到最高值，变化无统计学意义。结论 新生隐球菌、格特隐球菌刺激THP-1细胞炎性反应后，miR-146a表达随时间延长呈现不同的规律，TNF-α、IL-6的动态变化表现不同的特点。研究表明新生隐球菌、格特隐球菌诱导THP-1炎性反应可能存在不同的调控机制。

微小RNA-146a； 新生隐球菌； 格特隐球菌； THP-1细胞； 炎性反应

中枢神经系统的真菌感染，以隐球菌侵袭最为常见，致病性隐球菌多为新生隐球菌和格特隐球菌。巨噬细胞通常被认为是防御真菌感染的第一道防线中重要免疫细胞。抵御隐球菌感染需要诱导适当的先天免疫反应，而过度的免疫激活可能导致机体损伤或急慢性炎性疾病[1]。因此，人体需要有效的免疫调节以避免隐球菌感染所诱发的不当免疫应答，这种不当免疫应答在隐球菌发病中起重要作用。

微小RNA（microRNA，miRNA）是在转录后水平上调节基因表达的一组非编码小RNA分子，广泛存在于各种病毒、线虫、植物及动物体内[2]。近年来，越来越多的报道显示miRNA在免疫细胞的分化和功能调节中起到了至关重要的作用，其中miR-146a在调节固有免疫、炎性反应、病毒感染以及一些人类疾病中发挥着重要的作用[3]。我们通过观察并分析miR-146a在新生隐球菌（标准株WM148）、格特隐球菌（标准株R265）刺激THP-1细胞中表达的差异及相关炎性因子表达变化，为探讨miR-146a在隐球菌性脑膜炎中的发病机制和可能调控靶点提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料

人单核细胞系THP-1细胞（购于中国科学院细胞库）；新生隐球菌标准株WM148、格特隐球菌标准株R265来源于（上海）第二军医大学长征医院皮肤科真菌保藏实验室；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；FBS购自美国Hyclone；人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）盒购自美国ebioscience；TRIzol（Invitrogen，美国）；TaqMan MicroRNA Reverse TranscriptionKit、TaqMan Universal PCR Master Mix、Taq-Man MicroRNA Assays（大连TaKaRa公司）；氯仿、异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1 细胞、菌株培养 人单核巨噬细胞系THP-1培养于含10 %胎牛血清（100 U /mL青霉素、100 U /mL链霉素），培养瓶置于37 ℃、5 %CO2、饱和湿度的培养箱中培养；每2～3 d更换培养液1次，细胞密度达80 %时传代培养。标准株WM148、标准株R265培养于YPD培养基（1 %酵母提取物、2 %蛋白胨和2 %葡萄糖）3～5 d，30 ℃培养，收集后灭菌0.9 % NaCl洗涤2次，并在56 ℃下失活60 min，计数。

1.2.2 细胞分组、处理 将THP-1细胞按1×106个/mL接种于六孔板，每孔加培养液至2 mL。实验分为2组：新生隐球菌诱导组、格特隐球菌诱导组。按照数量之比为5∶1比例将灭活隐球菌与THP-1细胞进行共培养0、3、6、9、12 h后，离心收集培养上清液和细胞沉淀，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定miR-146a的表达 采用TRIzol法提取细胞沉淀中的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳来检测总RNA质量，紫外分光光度计测定总RNA的浓度。采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit特异miRNA的茎环引物进行反转录，所有操作均在冰上完成。采用SYBR®Premix Ex TaqTM II （TliRNaseH Plus）检测试剂盒。按说明书加样在ABI7300定量PCR仪上扩增和检测，反应条件：95 ℃ 30 s，40个扩增循环（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）。选取使用U6作为内参照，获得Ct值后，miR-146a的相对表达量采用2-ΔΔCt计算。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，所用引物见表1。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清液中TNF-α、IL-6含量 按照ELISA试剂盒使用说明书步骤进行操作。置于分光光度计450 nm处测吸光值。根据标准品的线性回归方程来计算各组培养液中细胞因子TNF-α、IL-6相应浓度。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，各组间两两差异比较采用LSD-t检验，相关性采用双变量Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-146a在各组细胞中表达变化

新生隐球菌诱导THP-1细胞以后，3 h、6 h、9 h、12 h细胞中表达miR-146a量较0 h组明显升高，3 h达到最高值，随后逐渐下降（P＜0.05）。格特隐球菌诱导THP-1细胞3 h、6 h、9 h、12 h细胞中表达miR-146a逐渐升高，12 h达到最高值，9 h、12 h与0 h差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。见图2。

表 1 qRT-PCR引物信息表Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR in this study

图1 miR-146a表达倍数变化Figure 1 Fold change of miR-146a expression at different time points after induction by C. neoformans and C. gattii

图2 TNF-α表达量Figure 2 TNF-α expression at different time points after induction by C. neoformans and C. gattii

新生隐球菌诱导THP-1细胞后，IL-6在上清液中的表达3 h、6 h、9 h、12 h逐渐增加，但3 h与0 h差异无统计学意义，6 h、9 h、12 h与0 h差异有统计学意义（P＜0.05）；格特隐球菌在诱导后，上清液中IL-6的表达早期变化不明显，3 h、6 h与0 h差异无统计学意义（P＞0.05），9 h、 12 h逐渐增高，与0 h相比差异有统计学意义（P ＜0.05），见图3。

图3 IL-6表达量Figure 3 IL-6 expression at different time points after induction by C. neoformans and C. gattii

2.2 TNF-α、IL-6在各组上清液中表达变化

新生隐球菌诱导THP-1细胞以后，3 h、6 h、9 h、12 h上清液中TNF-α 的表达量逐渐升高，12 h达到最高值，与0 h相比差异均存在统计学意义（P＜0.05）；格特隐球菌诱导THP-1细胞3 h、6 h、9 h、12 h上清液中TNF-α 的表达均有所增高，12 h达到最高值，但3 h、6 h与0 h差异无统计学意义，9 h、12 h与0 h差异有统计学意义（P ＜0.05），

3 讨论

隐球菌脑膜炎预后凶险、治疗困难、死亡率高。近年来该病的发病率及死亡率在全球呈显著上升趋势[4]。具有致病性的隐球菌绝大多数为新生隐球菌和格特隐球菌，我国以新生隐球菌感染为主，格特隐球菌感染少见。流行病学显示2/3的隐球菌脑膜炎患者无已知免疫功能低下的基础疾病；这类“免疫功能正常”患者临床治疗困难[5]。

我们通过调节巨噬细胞的功能研究miR-146a在隐球菌感染中的作用，结果发现，新生隐球菌刺激以后miR-146a的表达3 h达到峰值，而格特隐球菌刺激后miR-146a表达缓慢升高，并在12 h测量时间点达到高峰。同时，在两种隐球菌刺激THP-1细胞以后新生隐球菌诱导组TNF-α、IL-6表达逐步升高；格特隐球菌诱导组TNF-α逐渐增高、IL-6的表达在诱导早期变化不明显。新生隐球菌刺激THP-1细胞以后，miR-146a、炎性因子的表达量和表达规律与格特隐球菌诱导组有明显差别，格特隐球菌诱导THP-1细胞炎性反应要轻。

已有研究表明：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的自身抗体生成是格特隐球菌性脑膜炎个体的危险因素之一[6]，GM-CSF抗体生成抑制GM-CSF的趋化作用，进而影响粒细胞的分化成熟和功能，从而不能有效地诱导保护性炎性因子去消灭病原微生物[7]。新生隐球菌、格特隐球菌对转基因小鼠的易感性也是不同的，HIV-1的转基因Tg小鼠对新生隐球菌易感性显著增强，而格特隐球菌变化不明显[8]。Cheng等[9]研究表明，在用C57BL / 6小鼠作为对象的实验中，3种格特隐球菌株由于抑制或未能有效激活嗜中性粒细胞的迁移，诱导的保护性炎性因子与新生隐球菌相比要少。

综上所述，新生隐球菌、格特隐球菌诱导单核巨噬细胞的过程中存在不同作用机制，miR-146a 在两者诱导单核巨噬细胞炎性反应中都发挥不同作用。不同病原菌与宿主机体的不同免疫状态的交互作用是隐球菌感染的内在机理，miR-146a等miRNA在新生隐球菌致病中具有重要调控作用，这方面将是新生隐球菌发病机制中深入研究的一个重要方向。

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Mechanistic study on the role of microRNA-146a in THP-1 cells-associated inflammatory response induced by Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii

WANG Yan, GAO Rui, CHEN Hong, CHEN Huan, JIN Yi, LIAO Ningxin, CHEN Jianghan. （Department of Dermatology, Aff i liated Changzheng Hospital, The Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003, China）

Objective To analyze the differential expression of microRNA-146a (miR-146a) in monocyte-macrophage cell line (THP-1 cells) after induction by Cryptococcus neoformans (C. neoformans, reference strain WM148) or Cryptococcus gattii (C. gattii, reference strain R265), and investigate the mechanism of miR-146a in regulating the inflammatory response of cryptococcal meningitis. Methods The cultured THP-1 cells were divided into two groups to be induced by C. neoformans or C. gattii, respectively. THP-1 cells were induced with inactivated WN148 (or R265) strains at multiplicity of infection (MOI) of 5 in all experiments. The supernatant and the cell pellet were collected separately after incubation. The expression of miR-146a was measured by real-time quantitative PCR (qRT-PCR) technique. The levels of TNF-α and IL-6 release were assayed by ELISA. Results The expression of miR-146a increased signif i cantly in the C. neoformans induction group compared to 0 h. It reached peak at 3 h (P＜0.01), and then declined gradually. The level of TNF-α increased in supernatant and reached peak at 12 h. The expression of IL-6 did not change signif i cantly at eachtime point. The expression of miR-146a and TNF-α increased gradually and reached peak at 12 h in the C. gattii induction group (P＜0.01), but the change did not reach statistical signif i cance at 3 h, 6 h time points. The expression of IL-6 gradually increased, and reached peak at 12 h time point. Conclusions Following stimulation with C. neoformans or C. gattii, the expression of miR-146a in THP-1 cells showed different patterns over time. The expression levels of TNF-α and IL-6 showed different patterns. These f i ndings suggest that there may be different regulatory mechanisms in the THP-1 cells-associated inf l ammatory response after stimulation by inactivated C. neoformans and C. gattii strains.

microRNA-146a; Cryptococcus neoformans; Cryptococcus gattii; THP-1 cells; inf l ammatory response

R379.5

A

1009-7708 ( 2017 ) 04-0393-04

10.16718/j.1009-7708.2017.04.009

2016-10-14

2017-01-09

国家重点专科建设项目。

1. 第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003；2. 南京金陵医院皮肤科。

王妍（1991—），女，硕士研究生，主要从事隐球菌脑膜炎分子机制研究。

陈江汉，E-mail: chenjianghancjh@126.com。