破骨细胞中NFATc1相关调节研究进展

李忠浩 丁宁 杨全增 闫亮 夏亚一*

1.兰州大学第二附属医院骨科，甘肃 兰州 730000 2.甘肃省骨科重点实验室，甘肃 兰州 730000

骨质疏松症正成为影响老年人健康的老年疾病之一，主要原因是骨吸收大于骨形成。人体骨骼受到成骨细胞与破骨细胞(osteoclast，OC)的动态平衡调节；OC通过重构自身细胞骨架形成一个吸收陷窝，并分泌氢离子及蛋白酶来降解骨矿物质和细胞外基质，一旦这个过程过表达就将发生骨组织疾病，而人体内存在着复杂的信号通路来调节OC发挥功能，其中NFATc1发挥着重要的转录调节作用[1-2]，实验发现NFATc1基因敲除的小鼠无法生成成熟OC并进行骨溶解，而NFATc1的异位表达则有效地使破骨细胞前体细胞(osteoclast precursor cell，OPC)在没有RANKL刺激的情况下仍可以分化为OC[3]。这说明NFATc1是介导OC生长中的重要开关，本文将对其相关调节研究做一综述。

NFATc1是NFAT家族中重要的一员，人类和小鼠的NFATc1为全长约150 kb的转录DNA[4]。NFATc1是OC分化过程中的重要转录因子，其N-末端结构域结合钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)去磷酸化而介导NFAT核转位，C-末端与DNA序列特异结合并和激活子蛋白1(AP-1)共同发挥作用；C-末端包含一个20kDa大小的残基416-591(NFATc1-DBD)也可以特异结合DNA，但其结合DNA能力相对较弱[3]。激活后，NFATc1即从细胞质转运进入细胞核并转录出OC特异性基因如TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase，抗酒石酸碱性磷酸酶)，CTSK(cathepsin K，组织蛋白酶K)和MMP-9(matrix metallopeptidase 9，基质金属蛋白酶-9)[5]。综上可知，NFATc1在调节OC方面发挥着不可替代的作用，其在体内的调节过程简介如下。

图1 NFATc1调控信号通路简图Fig.1 Schematic diagram of NFATc1 regulation signaling pathway

1 破骨细胞中NFATc1的上游信号通路

这一过程分为启动、扩增及靶向作用三个阶段[6]，其中启动及扩增阶段主要依赖NFATc1上游包括由RANK(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B，核因子κ B受体活化因子)-RANKL(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，核因子κ B受体活化因子配体)及协同刺激信号通路(costimnlatory signal)介导的一连串以NFATc1为靶点的信号通。见图1。

RANK-RANKL信号通路相关研究开展最早，RANK与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)结合后接受来自RANKL的信号，介导下游信号分子如核转录因子kappaB(NF-κB)，c-Jun和p38/c-fos表达，并激活其下游NFATc1转录过程。NFATc2与NF-κB结合后诱导初始NFATc1的激活[3]；c-Jun/NFAT信号轴对RANKL调节OC分化也发挥重要作用：Ikeda等[7]发现c-Jun阻断能抑制NFAT介导的骨溶解，而在c-Jun抑制小鼠中，即使阻断RANKL，NFAT的过表达仍可以介导OPC分化为TRAP(+)多核细胞破骨细胞样细胞，因而证明其上下游调节关系；Huang等[8]在p38抑制细胞中，过表达的c-fos仍可以介导出大量NFATc1，表明p38/c-fos在NFATc1激活中也是一条重要信号通道。

现有研究表明NFATc1持续转录主要由Ca2+和CaN通路维持。RANKL在OPC中激活PLCγ2(Phospholipase C Gamma 2，人磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cγ2)从而水解肌醇磷脂酰肌醇-4,5 -二磷酸生成肌醇-1,4,5 -三磷酸肌醇(InsP3)和甘油二酯(DAG)，InsP3诱导内质网释放Ca2+，细胞内骤升的Ca2+使钙调蛋白(Calmodulin)转换为活化形态，从而诱导CaN磷酸化及激活CaMKs9(calcium/calmodulin-dependent protein kinases，钙依赖性蛋白激酶)，最终使CaN去磷酸化NFATc1丝氨酸残基而发生核转位和NFATc1蛋白的激活[9]。但是RANK受体并不直接启动Ca2+信号，研究发现它作为免疫受体与其他受体共同作用，如人破骨细胞相关免疫球蛋白样受体(OSCAR)/PIR-A(paired immunoglobulin-like receptor，配对免疫球蛋白样受体)或TERM-2(triggering receptor expressed in myeloid cells，骨髓样细胞触发受体)/SIRPβ1(signal-regulatory proteinβ1，信号调节蛋白β1)受体复合体。在OPC中可以观察到ITAM(Immunoregulatory tyrosine activation motif，免疫调节酪氨酸活化基序)磷酸化后与PLCγ2及Syk结合导致其激活，其中，OSCAR/PIR-A与Fc受体共同γ亚单位(FcRγ)结合而TREM-2/SIRPβ1则与DNAX激活蛋白12(DAP12)结合从而促进Ca2+信号通路传导。DAP12缺失的小鼠骨折愈合更快，而FcRγ与DAP12双基因敲除小鼠(DAP12-/-FcRγ-/-)则由于OC分化缺陷出现骨过度硬化[10-11]。这些研究表明Ca2+信号通路对NFATc1的重要诱导作用。Takayanagi等[9]进一步发现，在没有RANKL刺激的情况下，对ITAM受体的刺激并不能激活Ca2+通道，因此ITAM相关受体只是协同增大RANK对NFATc1的刺激。最近的一项研究报道，部分激活GSK-3β异位表达突变体(GSK3β- s9A)可抑制RANKL介导的NFATc1表达和Ca2+振荡。此外，还发现在OPC中表达GSK3β- s9A变体的小鼠存在NFATc1核转位障碍[12]，说明糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)通过Ca2+信号通路对NFATc1的表达起抑制作用。

在NFATc1启动完成后，则进入扩增阶段以保持其持续高表达从而维持转录过程，这一过程受到NF-κB及Ca2+介导的NFATc1扩增信号通路调节。一方面，Takayanagi等[3]发现在OPC中启动RANKL信号1h后，NF-κB中的p50及p65与NFATc2结合诱导NFATc1表达，即引起短暂的NFATc1表达扩增(autoamplification)。因为OC特异基因TRAP中存在高度保守的AP-1/NFAT结合元件，且其与IL-2启动子中的协同AP-1/NFAT结合位点相似，故假设OC中NFAT发挥功能需要c-fos/AP-1。最终印证在OC分化过程中NFATc1确是c-fos/AP-1的主要标靶基因，在c-fos缺失细胞中，NF-κB明显升高[13-14]，这支持NFATc1和NF-κB在RANK通路中是c-fos的下游信号并表明c-fos/AP-1，NF-κB及NFATc2在NFATc1扩增中十分重要。另一方面，Ca2+介导激活NFATc1触发扩增回路并维持NFATc1依赖性转录过程持续进行[3,10]。有学者发现在分化阶段晚期添加钙神经素抑制剂KF506将抑制OC生成，这证明Ca2+信号能介导NFATc1激活也能触发NFATc1扩增。持续性的钙振荡诱导NFATc1通过自我诱导扩增而产生自我放大效应。G蛋白信号调节因子10(RGS10)通过竞争性结合Ca2+/钙调蛋白及三磷酸肌醇(PIP3)可控制PLCγ2并抑制钙振荡模式[15]。NFATc1扩增的Ca2+调节通路有钙振荡依赖通路及钙振荡非依赖通路，RANK受体启动子中高度保守的结构域启动RANK信号通路激活并继续介导ITAM而引起PLCγ2的激活。Kuroda等[16]之后又发现存在一条不需要RANKL/巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)介导的钙振荡非依赖通路，随之有人证明在此通路中，Cot激酶(cancer osaka thyroid)通过直接磷酸化作用加强了NFATc1的稳定并促进其积累[17]。综上，目前大部分研究主要集中在Ca2+依赖通路，而其他通路的进一步作用机制仍存在进一步研究价值。

2 破骨细胞中NFATc1的下游信号通路

NFATc1通过诱导和扩增调节靶细胞mRNA水平影响OC的分化、融合与功能，见图1。在OC分化中，OSCAR是NFATc1的目标基因[18]。对NFATc1的负性调节减弱，如NFATc1/ Blimp1(B lymphocyte induced maturation protein 1，B淋巴细胞诱导成熟蛋白1)/ Bcl6(B-cell lymphoma 6，B细胞淋巴瘤6)负性调节环及MafB(V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B)和IRF-8(Interferon regulatory factor 8，干扰素调节因子8)被抑制[19-22]。在OC融合过程中，NFATc1下游靶基因编码的蛋白发挥着重要作用，比如树突状细胞特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)、液泡膜质子泵亚基(atp6v0d2)和原癌基因酪氨酸蛋白激酶c-Src的底物TKS5/FISH。在TKS5缺陷的OC中，激活M-CSF及RANKL后尽管仍可分化出单核破骨细胞，但是无法诱导出多核破骨细胞；TKS5又可以部分修复c-Src敲除OC的磷酸化过程[23]。当整合素integrinβ3与骨基质中的玻璃体结合蛋白结合激活后，c-Src即与ITAM结合而磷酸化酪氨酸激酶Syk并介导融合[24-25]。在c-Src/Syk信号通路中，integrinβ3和c-Src是NFATc1的靶基因产物[26-27]。此外，在atp6v0d2缺陷小鼠中同样发现OC融合障碍，进一步研究发现原钙粘蛋白-7(protocadherin-7)与此过程有关[28]。骨溶解过程由OC泌酸降解骨质，几个NFATc1的目标基因编码出的蛋白参与这一过程，如氯离子通道CLC7，它是晚期细胞内/溶酶体内的氯离子通道，其位于OC吸收皱褶区域[27]；Cathepsin K可以使骨胶原变性[29]；TRAP可以将骨基质磷酸骨桥蛋白及骨唾液酸糖蛋白脱磷酸化[14]。Lu等[30]最新发现小眼畸形相关转录因子(Mitf)在NFATc1下游发挥正性调节作用，它可扩增NFATc1依赖破骨效应；Mitf和AP-1(Fos/Jun)、PU.1等结合NFATc1组成一个转录调节复合体。

3 NFATc1负性信号调节通路

NFATc1可诱导肝配蛋白B2(ephrinB2)的转录，而在OC谱系细胞中ephrinB2通过下调c-fos及NFATc1抑制OC分化，因此ephrinB2被认为是RANK信号通路介导的耦合信号分子[31]。此外，一种新的负性OC调节通路被发现，其涉及两个在RANKL介导下的转录抑制因子:Bcl6和Blimp1，他们形成一个NFATc1/Blimp1/Bcl6负性调节环路。Bcl6抑制破骨基因如DC-STAMP、NFATc1和Cathepsin K的表达，以及OC的分化。Bcl6基因敲除小鼠表现出破骨作用增强和骨量降低；而在适量OC存在条件下，Blimp1敲除小鼠表现出Bcl6高表达从而在RANKL介导的情况下抑制OC的分化并增加骨量，而Blimp1本身经验证是可以增加小鼠OC分化的。这说明Blimp1抑制Bcl6的表达，而Bcl6又抑制破骨基因的表达；除此之外，其他NFATc1负性调节信号如IRF8及Mafb也被陆续发现[19,22,32]。此外，Lhx2(LIM homeobox 2)最近被发现也能抑制NFATc1介导的破骨活动[33]。这提示我们是否在目前已经发现的信号中存在着NFATc1的负反馈调节机制，并且是否仍存在我们尚未发现的负反馈调节轴？

4 NFATc1信号的节律性调节

作为调节骨生长的重要分子，NFATc1在生物体内可能会受到激素的调节，而激素的调节一大特点就是具有节律性。日本学者通过将小鼠在12h的明/暗周期中饲养两周后于不同昼夜时点(Zeitgeber times，ZT)将小鼠处死，取小鼠股骨提取mRNA并检测OC相关基因和时钟基因表达水平。发现NFATc1的震荡时间节段与时钟基因如PER1/PER2相似，于是提出假设两者间存在着相似的基因结构。最终，在NFATc1的结构序列里找到了时钟基因中的关键结构E-box，芯片检测分析发现在NFATc1-613/-607和-5295/-5289位置上的E-box与脑与肌肉类芳香烃受体核转位子蛋白1(BMAL1)存在结合。为进一步验证，他们又将肾上腺切除小鼠在12小时的明/暗周期中饲养两周后于ZT12行地塞米松注射(3mg/kg b.w.)，在注射后不同时间处死小鼠，并取股骨mRNA分析。最终发现地塞米松注射后BMAL1与NFATc1E-box之间结合增加并且在注射4h和32h后达到峰值。以上研究表明NFATc1对OC的调节中存在着节律，而这种节律可能是由时钟蛋白调控并受肾上腺激素影响[34]。昼夜节律在骨代谢中普遍存在，其分子机制研究仍不十分清楚，而NFATc1是OC中重要的通路节点，介导着多条OC分化分子通路，因此，对NFATc1的节律调控研究是亟待研究的方向。

5 机械应力对NFATc1通路在破骨细胞中的调节

骨适应其环境,成骨和破骨细胞在体内受机械负荷，骨的塑形需要受到机械刺激，这些机械力的刺激来源于体重负荷；然而，很少有机械应力对OC影响的研究。Sumika等[35]研究表明短期对RAW264.7细胞施加拉力可激活RANKL通路；与对照组相比，实验组NFATc1mRNA水平在施加机械拉力后6 h下降，但在12 h和24 h升高。施加机械应力24 h后发现，尽管DC-STAMP mRNA和蛋白水平下降但是NFAT转录活性与对照相比显著增强。对RAW264.7细胞施加短期的机械应力后可减弱NFAT转录活动并下调DC-STAMP从而明显抑制OC生成。有研究发现,在人骨髓间充质干细胞(MSCs)和小鼠OPC中流体切力(FSS)可以增加促炎基因表达[36]；随后发现机械应力介导CaN-NFATc轴调节OC[37]。最新发现FSS可以使Ca2+在胞质中富集[38]，故可能继续通过Ca2+信号通路来调控NFATc1。在生理状态下，体内应力环境是多样、复杂且偶联的，机械负荷在调控成骨及破骨细胞生理功能中发挥重要作用，因此可预防或治疗骨质疏松[39]。而目前各种机械应力在OC的分子通路机制研究尚少，各种应力如何将力学信号转换并介导分子信号通路也未能阐释清楚；NFATc1作为调节骨形成的重要转录因子，其与机械应力间的关系非常值得研究。

6 结论

作为关键的转录调节因子，NFATc1在OC的分化及骨溶解等过程中扮演着重要的角色。随着对其研究的深入，越来越多相关的分子通路及靶点被发现，其无疑为日后以抑制OC分化、融合及骨溶解为目的的研究治疗提供了基础。值得注意的是，OC作为溶解骨的基本单位，其处于人整体内环境中，因此将承受外界机械应力及人体内各种激素及分子的影响，NFATc1作为诱导OC关键节点，其与各种刺激信号转化的关系，以及与其相关信号通路的机制仍十分具有研究价值。