骨膜蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义

曹宇，董文亮，刘亮，蔡相军

（中国人民解放军第202医院普外科，沈阳110003）

骨膜蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义

曹宇，董文亮，刘亮，蔡相军

（中国人民解放军第202医院普外科，沈阳110003）

目的探讨骨膜蛋白（PN）在乳腺癌组织及癌旁组织的表达及临床意义。方法选取临床确诊为乳腺癌的女性患者50例，采用免疫组化二步法，测定不同年龄、TNM分期、SBR分级、病理类型、是否伴有淋巴结转移等因素下，乳腺癌及癌旁组织中PN的高表达阳性率，并与正常乳腺组织中PN的表达进行比较。结果PN在乳腺癌及癌旁组织间质中表达，并随着TNM分期（P=0.024）、SBR分级（P=0.012）及淋巴结转移（P=0.035）的变化，PN高表达阳性率升高；年龄、病理类型与PN的高表达阳性率无明显关联。结论乳腺癌中PN的高表达阳性率与TNM分期、SBR分级、淋巴结转移密切相关，并且参与乳腺癌的病理进展过程，PN可能成为潜在的乳腺癌监测指标。

乳腺癌；免疫组化；骨膜蛋白

乳腺癌是比较常见的女性恶性肿瘤，随着自然和社会环境的不断变化，其发病率有逐年上升趋势，已成为危害现代女性健康的主要恶性肿瘤之一。肿瘤的发生受多种因素影响，骨膜蛋白（periostin，PN）是近10年来发现的影响因素之一。PN最早是TAKCSHITA等［1］在鼠成骨细胞系的cDNA文库中通过减法杂交和微分筛选技术发现和鉴定的一种新型骨膜素分子，主要由成骨细胞及其前体分泌产生，在骨形成中起重要作用，被称为成骨细胞特异性因子2。由于它在骨膜和牙周韧带的定位表达及在骨和牙齿的形成和结构维持中扮演重要角色，故被命名为“骨膜蛋白”。TILMAN等［2］发现PN在人体多种正常组织中表达，其表达量可能与组织纤维原细胞数量呈正相关，如人外周血和脾脏极低表达，唾液腺和胸腺低表达，皮肤、乳腺和卵巢高表达且波动显著，而胰腺、肝脏、淋巴结、肺、结肠等组织表达较均匀。在功能上，PN不仅参与骨、牙齿、心脏等组织的形成与结构的维持，还在体内机械应力增加时，获得性地高表达于富含胶原纤维的结缔组织，促进组织损伤修复与重塑，参与人体的病理、生理过程［3］。近年来的研究［4］表明，PN在多种肿瘤中也表达，尤其是在肿瘤间质中表达，与其在正常组织中表达有显著差异，被认为与恶性肿瘤的发生发展密切相关。有研究［5］发现PN可预测食管癌的预后，并促进食管癌侵蚀，而且IZUHARA等［6］在肺部病理实验中发现，PN作为外周血中的标志物可以反映治疗与疾病的进展。国内外研究己表明多种恶性肿瘤患者血清中有PN的表达，且其水平与肿瘤分期、转移、术后复发率及存活率等相关。本研究的目的是探讨PN在乳腺癌中的表达和临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取我院2014年至2015年临床确诊为乳腺癌的50例女性患者的手术切除组织标本，选取癌组织、癌旁组织（距离癌组织3～5 cm以上）及淋巴组织，进行蜡块包埋、切片。全部病例在诊断明确前均未进行化疗、放疗等治疗。患者年龄为30～65岁，平均年龄42.5岁。其中病理诊断为浸润性导管癌11例，黏液癌3例，导管内癌12例，Paget病伴低级别导管内癌5例，小叶癌6例，混合性（导管内癌及小叶癌）13例。选取癌旁组织及淋巴结均无转移的30例乳腺癌患者作为阴性对照。

1.2 试剂

一抗选用兔多克隆抗体PN，购自艾博抗（上海）贸易有限公司，适用于免疫组化的浓度为1∶100～1∶1 000，本研究选取的浓度为1∶1 000。二抗为Ultra-SensitiveTMS-P超敏试剂盒（鼠/兔），购自福建迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色：石蜡切片脱蜡和水化后，PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3 min。切片滴加1滴或者50 μL过氧化物酶阻断溶液，室温10 min，以阻断过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。抗原修复。切片浸入枸橼酸缓冲液中，放入高压锅中，达最大压强2.5 min，之后高压锅放入水池冲淋，冲凉后取出，自然冷却到室温10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。切片滴加山羊血清后，至于封闭盒中20 min。去除血清后，滴加一抗4℃过夜。复温20 min后，去除一抗，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加二抗置于封闭盒中15 min，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加三抗置于封闭盒中15 min，PBS冲洗4次，每次5 min。去除PBS，滴加DAB，显微镜观察3 min，自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝。梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3.2 阳性判定标准：以显色位置中电镜下所见蓝色染颗粒为准，强度超过背景内的非特异着色则标记阳性。任意选择5个400倍视野，并且任意抽取100个细胞进行观察。评估阳性表达个数占全部数量的比率以及染色程度。采用经典的染色强度与阳性细胞数比值双评分相乘法进行最终评定，并将最终评级作为统计学分析的依据。染色程度评分：基本不着色为0分，淡蓝色为1分，蓝色为2分，深蓝色为3分。阳性细胞个数比值评分：染色细胞个数占总细胞个数比值≤10%为1分，＞10%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分。以染色程度评分与阳性个数比值评分相乘后的分数为依据进行分级判定：≤3分为阴性（-），4～5分为弱阳性（+），6～7分为阳性（++），＞8分为强阳性（+++）。（-）～（+）为低表达，（++）～（+++）为高表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行分析，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验、Fisher精确检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PN蛋白在不同年龄乳腺癌患者中的表达

50例患者根据年龄分为＞50岁组和≤50岁组，＞50岁组PN蛋白的高表达阳性率为87.0%（20/23），≤50岁组PN蛋白的高表达阳性率为85.2%（23/27），差异无统计学意义（χ2=0.032，P＞0.05）。见表1。

2.2 PN蛋白在不同TNM分期乳腺癌患者中的表达

随着TNM分期的不断增高，PN蛋白在乳腺癌癌细胞间质中的表达明显增高，其中T1期、T2期PN蛋白的高表达阳性率为73.9%（17/23），T3期PN蛋白的高表达阳性率为96.3%（26/27），差异有统计学意义（χ2=5.065，P＜0.05）。见图1、表1。

2.3 PN蛋白在不同SBR分级乳腺癌患者癌组织中的表达

SBR分级为Ⅰ、Ⅱ级（高分化）时PN蛋白的高表达阳性率为71.4%（15/21），SBR分级为Ⅲ级（低分化）时PN蛋白的高表达阳性率为96.6%（28/29），差异有统计学意义（χ2=6.257，P＜0.05）。见表1。

2.4 PN蛋白在不同病理类型乳腺癌患者组织中的表达

在不同的病理分型中，PN蛋白在癌及癌旁组织的高表达阳性率也不同。PN蛋白在黏液腺癌中的高表达阳性率为33.3%，在导管癌中的高表达阳性率为91.7%，在浸润性导管癌中的高表达阳性率为81.8%，在乳头湿疹样癌中的高表达阳性率为100.0%，在小叶癌和混合性癌中的高表达阳性率分别为82.3%和92.3%，差异无统计学意义（χ2=8.670，P＞0.05）。见表1。

图1 PN在不同TNM分期的乳腺癌及其癌旁组织中的表达×400Fig.1 Expression of PN in breast cancer of various TNM stages and adjacent tissue×400

表1 乳腺癌中PN的表达与临床因素之间的关系Tab.1 The relationship between the expression of periostin and clinical factors in breast cancer

2.5 PN蛋白在淋巴结转移乳腺癌患者中的表达

50例患者中有淋巴结转移患者PN蛋白的高表达阳性率为93.8%（30/32），无淋巴结转移患者PN蛋白的高表达阳性率为72.2%（13/18），差异有统计学意义（χ2=4.434，P＜0.05）。见表1。

3 讨论

本研究发现PN在乳腺癌中的高表达与其临床分期、细胞分化程度、淋巴结转移有密切关系，这一结果与RATAJCZAK-WIELGOMAS等［7］的研究结果相似，其研究报道乳腺癌中PN的高表达与肿瘤恶性程度相关。本研究中免疫组化结果证实，PN主要表达于乳腺癌细胞的间质中，在癌细胞的胞膜及胞质中表达为阴性，但在转移的淋巴结中有少量的PN表达。这提示在转移的淋巴结中PN的表达具有某种生物学作用，可能参与了乳腺肿瘤淋巴结的转移病理过程。在动物实验中，WANG等［8］在小鼠实验中证实，去除小鼠PN mRNA后，缺少PN表达的肿瘤细胞其FAK和Akt/PKB信号通路激活减少，并出现肿瘤细胞增殖、侵袭、转移减缓的现象，并由此推断PN可能是乳腺癌转移不可或缺的因子。KYUTOKU等［9］在深入研究PN结构及其搭载的外显子后，在小鼠内体内注入抗PN和其抗外显子编码的肽，结果显著抑制了小鼠乳腺癌细胞的增殖、迁移和入侵。而在人类细胞研究中，WANG等［10］也进一步证实，PN可以通过上皮间质转化促进人类乳腺上皮细胞向乳腺癌细胞的转化，抗PN的治疗可以延缓乳腺癌病理的发展，使其成为一种潜在的靶点。因此有理由推断，高表达的PN参与乳腺癌的病理过程，并为其提供适合肿瘤增殖、侵袭、转移的微环境。

FIELD、ISHIBA等［11-12］的研究证明，PN可以通过整合素αvβ3激活Akt/PKB通路促进肿瘤细胞的运动和入侵，使得PN在乳腺癌细胞中高表达，诱导正常细胞转化为癌细胞，并在动物实验中对比人表皮生长因子受体2后发现，PN的表达不仅可以监测肿瘤临床分期、淋巴结转移，还可以监测人表皮生长因子受体2的状态。血液检测也有类似的发现，NUZZO等［13］发现血清中PN的水平与癌症死亡率之间有特异相关性。因此，PN可能成为潜在的临床乳腺癌监测指标。

综上所述，PN主要在乳腺癌细胞的间质中表达，并参与乳腺癌的病理过程，具有一定的生物学作用，其高表达阳性率与乳腺癌的TNM分期、SBR分级、淋巴结转移密切相关，可能成为一种潜在的乳腺癌监测指标。

［1］TAKESHITA S，KIKUNO R，TEZUKA K，et al.Osteoblast-specific factor 2：cloning of a putative bone adhesion protein with homology with the insect protein fasciclinⅠ［J］.Biochem J，1993，294（Pt 1）：271-278.

［2］TILMAN G，MATTIUSSI M，BRASSEUR F，et al.Human periostin gene expression in normal tissues，tumors and melanoma：evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells［J］. Mol Cancer，2007，6：80.DOI：10.1186/1476-4598-6-80.

［3］郝敏，林江涛.骨膜蛋白的生物学功能及其在呼吸领域的研究进展［J］.国际呼吸杂志，2015，35（1）：70-73.DOI：10.3760/cma.j. issn.1673-436X.2015.01.018.

［4］CONWAY SJ，LZUHARA K，KUDO Y，et al.The role of periostin in tissue remodeling across health and disease［J］.Cell Mol Life Sci，2014，71（7）：1279-1288.DOI：10.1007/s00018-013-1494-y.

［5］UNDERWOOD TJ，HAYDEN AL，DEROUET M，et al.Cancerassociated fibroblasts predict poor outcome and promote periostindependent invasion in oesophageal adenocarcinoma［J］.J Pathol，2015，235（3）：466-477.DOI：10.1002/path.4467.

［6］IZUHARA K，CONWAY SJ，MOORE BB，et al.Roles of periostin in respiratory disorders［J］.Am J Respir Crit Care Med，2016，193（9）：949-956.DOI：10.1164/rccm.201510-2032PP.

［7］RATAJCZAK-WIELGOMAS K，GRZEGRZOLKA J，PIOTROWSKA A，et al.Periostin expression in cancer-associated fibroblasts of invasive ductal breast carcinoma［J］.Oncol Rep，2016，36（5）：2745-2754.DOI：10.3892/or.2016.5095.

［8］WANG Z，XIONG S，MAO Y，et al.Periostin promotes immunosuppressive premetastatic niche formation to facilitate breasttumour metastasis［J］.2016，239（4）：484-495.DOI：10.1002/path.4747.

［9］KYUTOKU M，TANIYAMA Y，KATSURAGI N，et al.Role of periostin in cancer progression and metastasis：inhibition of breast cancer progression and metastasis by anti-periostin antibody in a murine model［J］.Int J Mol Med，2011，28（2）：181-186.DOI：10.3892/ ijmm.2011.712.

［10］WANG X，LIU J，WANG Z，et al.Periostin contributes to the acquisition of multipotent stem cell-like properties in human mammary epithelial cells and breast cancer cells［J］.PLoS One，2013，8（8）：e72962.DOI：10.1371/journal.pone.0072962.

［11］FIELD S，UYTTENHOVE C，STROOBANT V.Novel highly specific anti-periostin antibodies uncover the functional importance of the fascilin 1-1 domain and highlight preferential expression of periostin in aggressive breast cancer［J］.Int J Cancer，2016，138（8）：1959-1970.DOI：10.1002/ijc.29946.

［12］ISHIBA T，NAGAHARA M，NAKAGAWA T.Periostin suppression induces decorin secretion leading to reduced breast cancer cell motility and invasion［J］.Sci Rep，2014，4：7069.DOI：10.1038/srep07069.

［13］NUZZO PV，RUBAGOTTI A，ZINOLI L，et al.The prognostic value of stromal and epithelial periostin expression in human breast cancer：correlation with clinical pathological features and mortality outcome［J］.BMC Cancer，2016，16：95.DOI：10.1186/s12885-016-2139-y.

（编辑陈姜）

Expression and Clinical Significance of Periostin in Breast Cancer

CAO Yu，DONG Wenliang，LIU Liang，CAI Xiangjun

（Department of General Surgery，Chinese People’s Liberation Army 202 Hospital，Shenyang 110003，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of periostin（PN）in breast cancer and its adjacent tissues.Methods We evaluated 50 women with breast cancer.We determined PN expression by immunohistochemistry and analyzed positive expression in the tumors and adjacent tissue by patient age，TNM stage，SBR type，pathological type，lymph node metastasis，and other factors.Results PN expression in breast cancer and cancer adjacent tissues was associated with an increase in TNM staging（P=0.024），SBR type（P=0.012），and lymphatic metastasis（P=0.035）.However，there was no significant correlation between age or pathological type（P＞0.05）.Conclusion Expression of PN in breast cancer is associated with TNM staging，SBR type，and lymph node metastasis，and is involved in the pathological progression of breast cancer.PN may be a potential prognostic marker for breast cancer.

breast cancer；immunohistochemistry；periostin

R737.9

A

0258-4646（2017）07-0628-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.012

辽宁省科学技术计划（2013225089）

曹宇（1987-），男，医师，硕士.

蔡相军，E-mail：caixiangjun61@126.com

2017-01-13

网络出版时间：