色素上皮衍生因子对大鼠急性视神经损伤超微结构的影响

赵军波++++++王斌++++++严肖啸++++++崔翠

[摘要] 目的 探討色素上皮衍生因子（PEDF）对大鼠视神经急性损伤后视网膜神经节细胞（RGCs）轴突线粒体超微结构的保护作用。 方法 选取健康雌性SD大鼠60只随机分为三组：空白组、模型组和实验组，每组各20只，空白组不做任何处理，模型组和实验组均采用视神经钳夹法用反向镊钳夹左眼视神经造成视神经不全损伤，右眼不予处理。模型组和实验组左眼造模后即刻、1周、2周分3次分别向玻璃体腔注射平衡盐溶液5 μL和PEDF 1 μg。三组大鼠均在第3周时取材，分别取10只大鼠左眼眼球制作标本，电镜下观察视网膜组织超微结构的改变；并将三组剩余大鼠左眼眼球制备成5 μm视网膜切片，常规HE染色后对视网膜神经节细胞进行计数。 结果 透射电镜观察模型组与实验组同空白组相比均存在线粒体水肿、胞质浓缩轴突肿胀。同模型组相比实验组胞质浓缩轴突肿胀轻，线粒体结构较完整。HE染色实验组和模型组的神经节细胞数都明显低于空白组（P < 0.05），实验组神经节细胞从细胞形态上要好于模型组，且RGCs数量较模型组多。模型组和实验组神经节细胞计数较空白组分别下降73.3%、53.3%，两者差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 视神经不全损伤可引起视神经超微结构的明显损害，PEDF可以减轻视神经超微结构的损害，并减少视网膜神经节细胞凋亡。

[关键词] 色素上皮衍生因子；视网膜神经节细胞 急性视神经损伤；超微结构；线粒体

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0028-04

Effect of pigment epithelium derived factor on ultra structure of acute optic nerve injury in rats

ZHAO Junbo1 WANG Bin2▲ YAN Xiaoxiao1 CUI Cui1

1.Department of Ophtalmology， Central Hospital of Handan， Hebei Province， Handan 056002， China； 2.Forth Department of Neurology， Central Hospital of Handan， Hebei Province， Handan 056002， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of pigment epithelium derived factor （PEDF） on mitochondria axon ultra structure of retinal ganglion cells （RGCs） in rats after acute optic nerve injury. Methods 60 SD rats were randomly divided into 3 groups： blank group， model group and experiment group， each group included 20 rats. The blank group was not given any disposal， rats in model group and experiment group were treated with forceps clamping left eye optic nerve to cause incomplete injury of optic nerve， the right eye was not given any disposal. The model group and experiment group， the left eyes models successfully made immediately， at 1 week and 2 weeks， the rats was injected balanced salt solution 5 μL and PEDF 1 μg into vitreous cavity respectively. Rats of three groups were harvested at the third week， 10 rats left eyeball were taken out to make specimens in each group， changes of retinal ultra structure was observed by the electron microscopy； the remaining rats were prepared to make 5 μm retinal slices， the retinal ganglion cells were counted by routine HE staining. Results Mitochondria edema， cytoplasm condensed axon swelling existed in model group and experiment group， compared with the blank group by observing with the electron microscopy. Compared with model group， the degree of cytoplasm condensed axon swelling was lesser， and structure was more completely in the experiment group. HE staining showed ganglion cells in the experiment group and model group were less （P < 0.05）， cell morphology of ganglion cells were better and the number of RGCs were more in experiment group. The number of ganglion cell counts in model group and experiment group decreased by 73.3% and 53.3% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Incomplete injury of optic nerve can cause obvious damage to the ultra structure of the optic nerve， and PEDF can relieve the damage of the ultra structure of the optic nerve.， also can weaken the apoptosis of RGCs.

[Key words] Pigment epithelium derived factor； Retinalganglion cells； Acute optic nerve injury； Ultra structure； Mitochondria

色素上皮衍生因子（PEDF）是Tombran-Tink等[1]从体外培养的胎儿视网膜色素上皮细胞中分离出的一种有效的内生性多功能因子。此后又从人类和小鼠中克隆并纯化出PEDF[2]。近年来又发现其具有抑制新生血管形成、营养保护脑神经、抗氧化等功能[3]。关于PEDF对视网膜神经节细胞保护作用的研究多集中在减轻氧化应激损害、减轻光损害、缺血-再灌注损害等，而关于外伤性急性视神经损伤后PEDF对视神经损伤修复的报道不多。本实验通过对视神经急性损伤后超微结构的观察，探讨PEDF对外伤性视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用。

1材料与方法

1.1实验动物

健康雌性SD大鼠60只（由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：1508079），体重0.20～0.25 kg，眼部检查无眼疾。

1.2方法

1.2.1 动物模型制作及给药方法 将60只大鼠随机分为：空白组、模型组和实验组，每组各20只。模型组和实验组均采用视神经钳夹法将左眼制成视神经损伤模型[4]，右眼不予处理。模型组和实验组在禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，显微镜下操作，沿角膜缘处用眼科手术剪剪开颞侧球结膜，用弯剪钝性分离并充分暴露视神经，在球后视神经2 mm处用反向镊钳夹住视神经，夹持力为98 g，夹住视神经20 s，造成视神经不全损伤。致伤眼瞳孔散大，检眼镜查眼底，无视网膜出血者为制模成功。制模成功后模型组即刻向玻璃体腔注射平衡盐溶液5 μL，而实验组即刻向玻璃体腔注射PEDF 1μg。模型组之后的1、2周再次向玻璃体腔注射平衡盐溶液5 μL，而实验组同样在1、2周时向玻璃体腔注射PEDF 1 μg。

1.2.2 组织制备 三组大鼠均在第3周时取材，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，球后视神经2 mm处剪断视神经并摘除整个眼球，4%多聚甲醛固定24 h后行眼内容剜除，将后段眼环用生理盐水冲洗血迹4%多聚甲醛固定，4°冰箱保存。

1.2.3 电镜标本的制作与观察 随机在三组各取10只大鼠的后段眼环组织将其分割切成1 mm×1 mm组织条，选择位于视乳头周围1.5 mm组织，标记后送电镜室，由专业人员将其制成50 nm超薄切片（视神经为横断面切片），染色后透射电镜（型号：日本日立H-7500）观察、照相。

1.2.4 视网膜HE染色 将三组剩余大鼠的后段眼环组织乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。将包埋好的眼球标本，按平行于视神经矢状轴为平面的视网膜进行连续切片，切片厚度约5 μm。将做好待用的切片进行HE染色。每张组织标本切片取4个光学显微镜下的视野，以视盘为中心，以1.5 mm为半径形成的圆形范围内，四个方向对称各取1个视野，每个眼球只抽取和使用1张切片。使用图像分析系统对制备好的标本切片进行分析，光镜（型号：日本BX51T-PHD-J11）下观察视网膜形态学变化并对每张切片4个视野的视网膜神经节细胞进行计数，取其均值作为该切片的计数结果。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠视神经的超微结构改变：

空白组视神经髓鞘完整轴浆均匀， 轴浆内可见清晰的正常微管、微丝和线粒体（图1A）。视神经损伤模型组核质、胞质水肿，细胞器减少，线粒体水肿空泡化，粗面内质网扩张，颗粒融合、脱颗粒现象（图1B）。实验组染色质边移，轻度厚薄不匀，线粒体数量较模型对照组多， 且结构较完整，胞质浓缩轴突肿胀轻（图1C）。

2.2 HE染色的视网膜切片形态学观察和RGCs计数

PEDF实验组（14.25±1.65）（图2A，封三）和模型组（7.98±1.69）（图2B，封三）的神经节细胞数都明显低于空白组（29.62±2.24）（图2C，封三），差异有统计学意义（P < 0.05）。实验组神经节细胞从细胞形态上要好于模型组，且RGCs数量较模型组多，模型组和实验组神经节细胞计数较空白组分别下降73.3%、53.3%，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

PEDF由眼内多种组织合成如视网膜、脉络膜等，并分泌作用于眼内视网膜神经节细胞等多种组织。在胎儿的视网膜色素上皮细胞、某些神经母细胞、视网膜、脉络膜、睫状体、角膜内皮细胞等均有PEDF表达[5]。研究发现PEDF在胎儿和青年人的视网膜色素上皮（RPE）细胞中的表达要明显高于正常人体眼球内的表达。目前已知PEDF对神经系统中的许多部位有分化、营养和保护作用，例如初级海马神经元、小脑颗粒细胞（CGCs）和脊髓运动神经元等[6]。有研究显示其浓度为0.1 nm时就可以促进细胞生存和轴突生长[7]，并能够使鸡胚胎的脊髓运动神经元分化加快，并促进存活[6]。PEDF可以保护小鼠视网膜神经元、视杆细胞减轻过氧化氢或光损害导致的细胞减少、细胞坏死等改变[8]。PEDF不仅对急性神经损伤、中毒有保护作用，还可对抗其慢性神经损害，起神经营养和保护作用[9]。在高灌注等眼部缺血损伤模型中证实PEDF可保护视网膜神经元细胞抑制其凋亡[10]。目前PEDF营养神经的作用机制尚不清楚[11]。有研究显示PEDF可能通过改变钙离子在细胞内外的浓度而起到神经保护作用，在实验模型中显示PEDF可以降低小脑颗粒细胞钙离子浓度的峰值，这提示PEDF可能是调节细胞膜的钙泵、钠钙交换器、钙离子结合蛋白等钙离子清除机制，而不是直接抑制电压敏感性钙离子通道，从而起到对抗谷氨酸盐神经毒性作用，使得细胞生存延长[12]。PEDF改变钙离子在细胞内外的浓度可能也是通过多通道共同作用的结果，其可以使细胞凋亡过程开始后线粒体形态和位置改变变轻，从而使得钙离子通道发生改变，也可以作用于一些抑制凋亡因子或促凋亡因子而發生作用，但这些仍需进一步实验研究，关于PEDF保护成熟运动神经元的调节机制是否同细胞内外钙离子浓度平衡有关还没有得到充分证实[13]。此外Yabe等[14]的研究证实PEDF还可通过激活NF-κB信号转导途径而使抑制凋亡因子Bcl-2等表达上调而发挥神经保护作用[15]。因此，PEDF可抑制凋亡，并提高视网膜Bcl-2蛋白表达，Bcl-2可通过抑制线粒体在凋亡因素刺激下形态变化、功能缺失与结构破坏，保持线粒体膜电位的稳定，抑制Bax的移动和作用，阻止线粒体通透性转换孔和Caspase的开发及激活减缓细胞凋亡[16]。另外，Tsao 等[17]研究发现PEDF 能够诱导细胞外信号调节激酶（ERK1 /2） 蛋白磷酸化使其活化，而对氧化应激状态下的RPE 发挥保护作用[18]，这提示 ERK1 /2 通路可能也是PEDF神经保护的一个作用方向。Amano等[19]研究发现PEDF可通过上调高糖或者H2O2暴露周细胞中谷胱甘肽过氧化物酶的水平并增强其活性并活化Caspase-3起到抗凋亡的作用[18]。

本实验通过钳夹视神经成功制作外伤性视神经损伤动物模型，实验中笔者从视神经节细胞的观察及计数可发现模型组和实验组RGC层排列明显稀疏，数目较空白组明显减少，神经纤维空泡样变性，细胞形态紊乱。实验中观察大鼠视网膜的超微结构可以发现模型组和实验组视网膜均出现不同程度的病变。如线粒体数量减少、线粒体水肿、胞质水肿。线粒体是人体内重要的细胞器，在视网膜和视神经内含量较高，为视觉信号传导和细胞生命活动提供必需的能量，线粒体功能异常可导致RGCs凋亡。视神经损伤后由于多种因素作用可致使线粒体膜通透性转换孔开放，造成线粒体通透性改变、肿胀、外膜破裂，导致细胞色素c释放，细胞色素c释放不但能激活Caspase，致使Caspase-3活化，还可以导致线粒体膜电位崩溃，Ca2+外流，这些又进一步加剧了线粒体膜通透性转换孔开放，引发恶性循环，最终致造成神经节细胞不可逆性的损伤[20]。本实验的观察结果也从超微结构病变发展的角度提示了RGCs凋亡乃至死亡均可能因外伤性视神经损伤引起的RGCs线粒体超微结构的损害。线粒体的功能缺失与结构破坏，是导致RGCs凋亡乃至死亡的机制。此外同模型组相比实验组胞质浓缩轴突肿胀轻， 线粒体数量较模型对照组多， 且结构较完整。且RGCs数量较模型组多。这说明PEDF减缓或抑制了凋亡，抑制了视神经损伤后多种损伤因素刺激下线粒体的去极化，减少了凋亡诱导因子的释放，发挥了保护视网膜神经节细胞的作用。这为临床上预防和治疗诸如外伤性视神经病变、青光眼性视神经病变、缺血性视神经病变等视神经病变的治疗提供了新的思路。关于PEDF神经保护作用的具体作用机制很可能是通过多种机制共同调节的结果，其作为一种可能的新的神经保护剂，作用机制仍需进一步实验研究。

[参考文献]

[1] Tombran-Tink J ， Johnson LV . Neuronal differentiation of retinoblastoma cells induced by medium conditioned by human RPE cells [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1989，30（8）：1700-1707.

[2] Steele FR，Chader GJ，Johnson LV，et al. Pigment epithelium-derived factor： neurotrophic activity and identification as a member of the serine protease inhibitor gene family [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（4）：1526-1530.

[3] Ogata N，Wang L，Jo N，et al. Pigment epithelium derived factor as a neuroprotective agent against ischemic retinal injury [J]. Curr Eye Res，2001，22（4）：245-252.

[4] 刁金美，冯国栋，游思维，等.用于中枢神经系统Waller变性研究的新型大鼠视神经夹伤模型[J].神经解剖学杂志，2008，24（3）：239-244.

[5] 江新利，赵平，刘岩.PEDF在眼部疾病中的研究进展[J].眼科新进展，2013，5（5）：485-488.

[6] 李锐，盛文利.色素上皮源性因子-神经营养和保护因子[J].国外医学神经病学神经外科分册，2005，32（3）：289-292.

[7] Houenou LJ，D'CostaAP，Li L，et al. Pigmentepithelium-derivedfactor promotes the survival and differentiation of developing spinalmotor neurons [J]. J Comp Neurol，1999， 412（3）：506-514.

[8] CaoW，Tombran-Tink J，EliasR，et al. In vivo protection ofpho-toreceptors from light damage by pigment epithelium-derived factor [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42（7）：1646-1652.

[9] 胡鷺萍，徐国兴.色素上皮衍生因子在视网膜疾病中的应用研究进展[J].海峡科学，2007（3）：73-78.

[10] Stellmach，V，Crawford，SE，Zhou，W，et al. Prevention of ischemia-induced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic agent pigment epithelium-derived factor [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（5）：2593-2597.

[11] Valnickova Z，Petersen SV，Nielsen SB，et al. Heparin binding induces a conformational change in pigment epithelium-derived factor [J]. Biol Chem，2007，282（9）：6661-6667.

[12] 李锐，盛文利.色素上皮源性因子-一种新的神经营养和保护因子[J].中山大学研究生学刊，2004，25（4）：21-27.

[13] Tombran-Tink J，Barnstable CJ. PEDF： amultifaceted neu？鄄rotrophicfactor [J]. Nat Rev Neurosci，2003，4（8）：628-636.

[14] Yabe T，Wilson D，Schwartz JP. N F-kappa B activation is required for the neuroprotective effects of pigment epithelium-derived factor（PEDF）on cerebellar granule neurons [J]. J Biol Chem，2001，276（46）：43313-43319.

[15] 王亞娜，高莎，沈玺.色素上皮衍生因子对氧诱导视网膜神经节细胞凋亡及Bcl-2表达的影响[J].眼科新进展，2014，34（6）：501-505.

[16] Tan KO，Fu N Y，Sukumaran SK，et al. MAP-1 is a mitochondrial effector of Bax [J]. Proc Natl A cad Sci USA，2005，102（41）：14623-14628.

[17] Tsao YP，Ho TC，Chen SL，et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits oxidative stress-induced cell death by activation of extracellular signal-regulated kinases in cultured retinal pigment epithelial cells [J]. Life Sci，2006， 79（6）：545-550.

[18] 李瑞霞，陈海冰.色素上皮衍生因子与氧化应激[J].医学综述，2012，18（13）：1968-1970.

[19] Amano S，Yamagishi S，Inagaki Y，et al. Pigmentepithelium-derived factor inhibits oxidative stress-induced apoptosis and dysfunction of cultured retinal pericytes [J]. Microvasc Res，2005，69（1/2）：45-55.

[20] Kinnally KW，Peixoto PM，Ryu SY，et al. Is mPTP the gatekeeper for necrosis，apoptosis or both？ [J]. Biochim Biophys Acta，2011，1813（4）：616-622.

（收稿日期：2017-02-11 本文编辑：苏 畅）