一株人血源猪链球菌的分离鉴定与毒力基因检测

吕燕宁，李 洁，杜轶威，黎新宇， 王全意，陈丽娟



一株人血源猪链球菌的分离鉴定与毒力基因检测

吕燕宁1，2，李 洁1，杜轶威1，黎新宇1， 王全意1，陈丽娟1

目的 对北京某医院就诊的一例疑似人感染猪链球菌病患者的血液来源菌株进行鉴定与毒力因子检测分析。方法 将患者血液分离菌株接种哥伦比亚血琼脂平板，经革兰氏染色镜检、血清凝集试验、VITEK 2 Compact微生物分析仪以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测后，再用PCR技术检测猪链球菌种特异性基因(16S rRNA)和猪链球菌2型特异性荚膜多糖编码基因(cps2J)以及多个毒力基因：溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、溶血素(sly)、细胞外蛋白因子(ef)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的编码基因和毒力相关基因orf2。结果 传统细菌鉴定方法和蛋白质谱技术以及核酸检测方法将这株患者血源性细菌分离株鉴定为猪链球菌2型，该菌株的毒力基因cps2J、sly、ef、gdh、fbps、gapdh和orf2的PCR检测均为阳性，mrp基因为阴性。结论 该株人血源细菌分离株为猪链球菌2型sly+/ef+/mrp强毒株。

猪链球菌；VITEK；MALDI-TOF-MS；毒力基因；聚合酶链反应

猪链球菌(S.suis)是一种人兽共患病病原体，根据其荚膜抗原的差异，猪链球菌可分为35个血清型，即1～34型和1/2型。其中猪链球菌2型流行最为广泛，不仅能引起大规模的动物疫病而导致生猪养殖业的巨大经济损失，还可引起人偶发病例甚至造成人间疫情的暴发，严重者致人死亡，对公众健康尤其是高危人群的生命安全构成严重威胁，是一种危害严重的人兽共患病病原。近年来国内已发生多起人感染猪链球菌病疫情，九十年代末我国江苏省部分地区，连续两年出现由猪链球菌2型引起的猪群疫病暴发，数万头生猪死亡，数十人感染猪链球菌病，死亡14例[1]；2005年四川省发生了国内外迄今为止报告的最大规模人感染猪链球菌病疫情，200多人感染，38人死亡[2]，也由猪链球菌2型引起的；人感染猪链球菌病散发病例在其它省份也时有发生[3-5]。因此对该致病菌的快速鉴定与甄别以及毒力分析可以为患者的快速诊断和有效治疗以及突发疫情的迅速处置提供依据。本研究对2015年在北京市某医院就诊的1例人感染猪链球菌疑似病例血液中分离的菌株进行了分离鉴定与毒力分析，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 病例信息 患者张某，男，52岁，来自河北省廊坊市，于2015年12月11日发病，就诊于当地医院，病情加重后于13日转至北京某医院急诊科，主要症状为意识障碍，谵妄，躁动不安，伴有发热、恶心、呕吐，二便失禁。患者在工作单位负责猪、牛、羊、驴、鸡、鸭的饲养工作，其住所临近猪舍，2014-2015年其工作场所均有病死猪情况发生，发病前1周，患者接触过1只病死猪，对病死猪去毛时，手部有伤口。临床诊断为人感染猪链球菌病、化脓性脑膜炎、急性脑梗死。

1.2 样本 该病例的血培养物(BD公司BACTEC Plus Aerobic/F血培养瓶，全自动需氧培养24 h)。

1.3 试剂 哥伦比亚血琼脂平板(货号为PB0123A)购自英国OXOID公司，猪链球菌1型和2型抗血清(货号分别为22280 Type 1和22280 Type 2)购自丹麦SSI公司，猪链球菌2型单克隆抗体由中国疾病预防控制中心提供，VITEK2革兰氏阳性细菌鉴定卡(货号21342)购自法国生物梅里埃公司，PCR试剂为Invitrogen Platinum○RPCR SuperMix(货号11306-016)购自美国赛默飞公司。

1.4 仪器 法国生物梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统，德国布鲁克公司的MALDI Biotyper微生物快速鉴定系统，美国伯乐公司的iCycler PCR仪以及德国Qiagen公司的毛细管核酸电泳仪QIAXCEL。

1.5 细菌分离培养与染色镜检 将血培养物取200 μL接种于血琼脂平板划线培养，置37 ℃，5%二氧化碳培养箱培养24 h，观察菌落特征，挑取单个可疑菌落进行革兰染色后镜检。

1.6 血清分型试验 挑取菌落分别与猪链球菌1型和2型抗血清做玻片凝集试验，同时设生理盐水对照。

1.7 筛检生化试验 触酶实验，取洁净玻片1张，接种环挑取菌落，加3% H2O21滴，立即观察结果。

1.8 VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪检测 挑取单个菌落转种血琼脂平板，于37 ℃，5%二氧化碳培养箱培养24 h。用消毒棉签沾取适量菌苔，以0.45%的氯化钠溶液配制浓度为0.5～0.65 Mac单位的菌悬液3 mL；将预温25 ℃的VITEK 2革兰氏阳性细菌鉴定卡用已配制好浓度的菌悬液进行自动填充后，置于读卡器中进行反应，反应结束后仪器自动读卡并打印出最终结果。

1.9 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测 以5 mL乙腈 + 0.25 mL三氟乙酸(TFA)+ 4.75 mL纯水配制10 mL标准溶剂。以标准溶剂配制饱和HCCA基质溶液(终浓度为10 mg/mL)备用。以接种环取单一菌落，加入1 mL 70%乙醇振荡灭活，离心去上清，再向沉淀中加入70%甲酸50 μL以及乙腈50 μL，振荡离心取上清待测。取1 μL上清滴于样品盘上晾干，再加上1 μL基质溶液，晾干后上机检测。

1.10 猪链球菌靶基因检测 菌株DNA制备:刮取1-2接种环菌苔加入150 μL三蒸水中，振荡混匀制成菌悬液，100 ℃煮沸10 min；14 500 r/min离心10 min，取上清液于-20 ℃冰箱中保存备用。参照相关文献的引物序列及PCR方法检测猪链球菌种特异的16S rRNA基因和猪链球菌2型cps2J基因以及其他毒力基因：荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、细胞外因子(ef)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gadph)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、粘连蛋白/纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)和毒力相关因子orf2。引物序列、退火温度及产物片段大小详见表1。反应体系(20 μL)为上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 1 μL、预混液17 μL混合而成。反应条件为预变性95 ℃、4 min，变性95 ℃、30 s，退火30 s，退火温度参见表1，延伸72 ℃、1 min，35个循环，最后延伸72 ℃、7 min。

表1 猪链球菌基因检测引物及其产物大小

Tab.1 Primers ofStreptococcussuisgene detection and product sizes

目的基因Targetgene引物序列(5′⁃3′)Primerssequence产物大小/bpSizeofproducts退火温度/℃Annealingtemperature参考文献References16SrRNACAGTATTTACCGCATGGTAGATAT32860[6]GTAAGATACCGTCAAGTGAGAAcps2JGTTGAGTCCTTATACACCTGTT45060[7]CAGAAAATTCATATTGTCCACCmrpGGTATACCTTGCTGGTACCGTTC53260[7]AGTCTCTACAGCTGTAGCTGGslyAGTTCGCACTTGATTTTAAG150051[7]AATACATTGCCAGATTACTCefACAAAGGCGTAGGTTCAATC26956[7]CGGCATCAAGAATGTCTTTGgdhGCAGCGTATTCTGTCAAACG65756[8]CCATGGACAGATAAAGATGGorf2CAAGTGTATGTGGATGGG85856[8]ATCCAGTTGACACGTGCAfbpsTGTCCTCAACATCCGCA18460[9]CATTGTCCAACTGACGAATCTCCTCgapdhTGACAAGAAAGTAACTGCTGA12348[9]CAATGAACCGAATGAGA

2 结 果

2.1 菌落特征与镜检结果 可疑菌株在血琼脂平板上培养24 h后出现细小突起、光滑湿润的圆形菌落，半透明略带灰白色、边缘整齐，聚集性菌苔周围呈明显的α溶血现象，单个菌落周围α溶血现象不明显，革兰染色后油镜下观察，细菌呈成对或短链状革兰氏阳性球菌。结果见图1。

图1 细菌的生长形态与革兰氏染色Fig.1 Growth form and Gram stain of the bacteria

图2 PCR检测结果Fig.2 PCR results

2.2 血清分型结果 分离菌株与猪链球菌2型抗血清以及猪链球菌2型单克隆抗体发生凝集反应，与猪链球菌1型抗血清不发生凝集反应。生理盐水对照未发生凝集现象。

2.3 筛检生化试验 无气泡产生，触酶试验阴性。

2.4 VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪检测结果 鉴定结果显示，分离菌株为猪链球菌2型。

2.5 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测结果 MALDI-TOF-MS鉴定结果显示该菌株与猪链球菌1型DSM 9683、DSM 9684和猪链球菌2型DSM 9682T(German Culture Collection，Braunschweig，Germany)最为相似，分值(Score Value)分别为2.341、2.268和1.870。

2.6 PCR检测结果 PCR检测结果显示猪链球菌种特异的16S rRNA基因、猪链球菌2型特有的毒力基因cps2J及毒力基因sly、ef、gdh、fbps、gapdh和orf2均出现预期大小的DNA扩增条带，为阳性；mrp则未见扩增条带，为阴性。结果见图2。

3 讨 论

猪链球菌是一种呈世界性分布的人兽共患病原菌，虽然有35个血清型，并非所有的血清型都有致病性，能感染人的致病血清型主要包括1、2、1/2、7、9和14型6种。毒力最强的是1型，而2型分布最广泛，是从病猪和患者中分离最多的一种血清型[10]，也是我国猪链球菌病疫情的主要流行株，但并不是所有的猪链球菌2型都具有致病性，其致病力取决于它的毒力因子，根据菌株毒力因子的差异，可将其分为强毒株、弱毒株和无毒株，因此对分离菌株的鉴定、分型以及毒力因子的检测分析对病人的诊断治疗和疫情处置很重要。

传统的细菌鉴定有一系列的流程和方法，耗时长，程序繁琐，通常还需要实验者具有一定的经验。MALDI-TOF-MS是近年来发展起来的一种新型的有机质谱技术，是一种利用蛋白质谱学的全新的微生物快速检测和鉴定技术，对于已经分离纯化的菌株能够在短至几分钟的时间内进行初步鉴定。目前应用MALDI-TOF-MS技术在检测和鉴定微生物方面国内外已经取得了很好的进展，尤其是在细菌的种属鉴定方面，有学者使用MALDI-TOF-MS方法鉴定了129株猪链球菌分离株，符合率可达96.9%[11]，可以很好的将菌株鉴定到属的水平。本研究中采用MALDI-TOF-MS方法对分离株进行鉴定，结果显示该方法可将可疑菌株鉴定为猪链球菌，但不能进一步精确区分血清型。因此我们进一步使用了猪链球菌1型和2型抗血清以及2型单克隆抗体进行了血清凝集试验，试验结果显示该菌株只能与2型抗血清发生凝集反应，提示该分离株为2型猪链球菌。

VITEK 2 compact系统是微生物快速检测分析系统，该系统能够准确快速地分析出菌株的鉴定结果。马丽梅等[12]应用此方法对111株猪链球菌进行了鉴定，其中110株为猪链球菌2型，1株为猪链球菌1型，正确率100%。因此作者认为VITEK 2 compact分析系统可作为一种简便快速的猪链球菌鉴定方法。但也指出，该实验所用的菌悬液配制浓度要非常准确，而且必须以培养18～24 h的新鲜菌落来配制，否则对鉴定结果的影响会较大。本研究应用VITEK 2 compact分析系统对疑似菌株进行了鉴定，并且做了重复实验，实验结果也显示该方法的鉴定结果并非每次都很稳定，其中一次鉴定结果显示为猪链球菌1型，这也是为什么我们要选择猪链球菌1型抗血清进行血清凝集试验来做进一步的确证，鉴定该菌株到底是1型、2型还是1/2型的原因。

分子生物学技术因其敏感、快速、准确的优点在细菌鉴定和分型方面得到越来越多的应用。猪链球菌16S rRNA基因片段具有种特异性，cps2J基因不仅是其毒力基因之一，也是猪链球菌2型的型特异性基因，可以作为鉴定猪链球菌2型的靶基因，本研究中该分离株的16S rRNA和cps2J基因均为阳性，提示本研究中的疑似菌株为猪链球菌2型菌株。猪链球菌2型的毒力因子与其致病性密切相关，是判定其毒力强弱的指标。目前认为猪链球菌2型的毒力因子主要有cps、mrp、sly、ef、gadph、gdh、fbps、orf2等[13]。ef和mrp的表达与猪链球菌2型菌株的毒力有显著关系。根据mrp和ef及其类似物的存在与否，猪链球菌2型存在着以下几种表现型：mrp+ef+、mrp-ef-、mrp+ef*(ef类似物)、mrp+ef-、mrp*(mrp类似物)ef-、mrp-ef*、mrp-ef+等。我国1998年江苏省及2005年四川省猪链球菌病疫情中的病猪体内分离到的菌株也为mrp+ef+型[14]。由于mrp和ef在非致病菌株中检出率很低，而在强毒株中检出率很高，因此mrp和ef常被认为是猪链球菌2型高致病性的标志，但其他毒力基因，如sly等也对猪链球菌的致病性起重要作用[15-16]。一般认为sly、mrp及ef3个毒力因子可用来区分高致病、低致病与非致病菌株，sly/ef/mrp阳性常被认为是与菌株的高致病性相关的[17]。然而，近年国外研究者从病猪中分离的多个2型猪链球菌菌株表现为sly-/ef-/mrp-/+[17-18]。2008-2011年从加拿大分离的127株2型猪链球菌中，52%为sly-/ef-/mrp+型，44%为sly-/ef-/mrp-型，并且研究者发现mrp-较mrp+菌株的毒力似乎更强[19]。陈经雕等[7]研究了22株来自人和猪的2型猪链球菌，其中有10株(7株人源、3株猪源)为sly+/ef+/mrp+型，另外10株分离自病人的菌株为sly-/ef+/mrp+，2株分离自病猪的菌株分别为sly+/ef+/mrp-和sly-/ef-/mrp-。总而言之，国内人源猪链球菌2型分离株多为sly+/ef+/mrp+型。本研究以cps2J、mrp、sly、ef、gadph、fbps、gdh和orf2为靶基因对疑似菌株进行了PCR鉴定，其结果除mrp基因外均为阳性，结合患者危重的临床表现，表明本例人血源分离菌株为表现型为sly+/ef+/mrp-的猪链球菌2型强毒株，与以往的研究结果略有差异，表明mrp基因并不是猪链球菌2型致病力强弱的决定性因素。

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Identification and virulence analysis of aStreptococcussuisstrain isolated from human blood

LYU Yan-ning1,2，LI Jie1，DU Yi-wei1，LI Xin-yu1，WANG Quan-yi1，CHEN Li-juan1

(1.BeijingCenterforDiseasesControlandPrevention，BeijingResearchCenterofPreventiveMedicine，Beijing100013，China;2.SchoolofPublicHealth，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

To identify and analyze the virulence of a bacteria strain isolated from the blood of a patient with suspectedStreptococcussuis(S.suis) infection in a hospital of Beijing，we inoculated the bacteria strain isolated from the blood of the patient to the Columbia with sheep blood agar plate，after Gram staining and microscopical examination，serum agglutination test，VITEK 2 Compact microbial identification system test and matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) test，S.suisspecies specific gene 16SrRNA，S.suisspecies serotype 2 specific virulence gene capsule polysaccharide 2J (cps2J) and virulence gene muramidase-released protein (mrp)，hemolysin (sly)，extracellular factor protein (ef)，glutamate dehydrogenase (gdh) genes，fibronectin-binding protein (fbps)，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh) genes and virulence correlated gene orf2 were further detected by PCR. Results showed that the suspicious bacteria strain ofS.suiswas identified asS.suistype 2 (S.suis2) by conventional methods，MALDI-TOF-MS and PCR. PCR results showed thatcps2J，sly，ef，gdh，fbps，gapdhandorf2 genes were positive，and mrp gene was negative. In conclusion，the bacteria strain isolated from the patient’s blood is sly+/ef+/mrp-virulentS.suis2.

S.suis; VITEK; MALDI-TOF-MS; virulence gene; PCR

Chen Li-juan，Email: bjcdcchlj@hotmail.com

国家科技重大专项(No.2012ZX10004215-003-001)资助

陈丽娟，Email：bjcdcchlj@hotmail.com

1.北京市疾病预防控制中心,北京市预防医学研究中心，北京 100013； 2.首都医科大学公共卫生学院,北京 100069

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.005

R378.1

A

1002-2694(2017)07-0599-05

2016-07-11 编辑：张智芳

Supported by the National Key Science and Technology Project of China (No. 2012ZX10004215-003-001)