Klotho蛋白联合红花注射液对小鼠心肌损伤的保护作用

樊 蓉， 苏显明, 郑二女

(1西安交通大学第一附属医院老年心血管内科，西安 710061；2西安141医院老年病科； *通讯作者，E-mail:suxianming2011@163.com)

Klotho蛋白联合红花注射液对小鼠心肌损伤的保护作用

樊 蓉1,2， 苏显明1*, 郑二女1

(1西安交通大学第一附属医院老年心血管内科，西安 710061；2西安141医院老年病科；*通讯作者，E-mail:suxianming2011@163.com)

目的 分析Klotho蛋白联合红花注射液(H)对小鼠心肌损伤的保护作用。 方法 采用异丙肾上腺(ISO)制备小鼠心肌缺血损伤模型。将60只6-7周龄小鼠分成生理盐水(NS)组、ISO组、Klotho(KL)组、丹红(H)组及KL+H组。分别计算心脏质量指数(HW/BW)，测定血清乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、血清Klotho浓度，心肌组织石蜡包埋行HE染色、Massion染色、Caspase3染色。 结果 ISO实验模型符合要求。与NS组比较，ISO组HW/BW、乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量均显著增加(P<0.01)，SOD活力显著减低(P<0.01)。KL组、H组、KL+H组HW/BW%、LDH活性、MDA含量均显著低于ISO组(P<0.01)，SOD活力、Klotho浓度显著高于ISO组(P<0.01)。KL+H组HW/BW%、LDH活性显著低于H组(P<0.01)，MDA含量显著低于H组(P<0.05)，SOD活力显著高于H组(P<0.01)，Klotho浓度显著高于H组(P<0.05)。HE染色结果显示：ISO组小鼠心肌细胞横径明显大于NS组，伴随着肌纤维紊乱和心肌间质成纤维细胞增生。治疗组小鼠心肌细胞横径明显小于ISO组；Masson染色结果显示，ISO组小鼠心肌间质及血管壁有大量胶原纤维分布，而治疗组小鼠的心肌间质及血管壁胶原纤维数量较ISO组明显减少；Caspase 3染色结果显示，各治疗组棕黄色染色颗粒分布较ISO组明显减少。染色阳性结果表现为胞质中有大量棕黄色染色颗粒分布。 结论 Klotho蛋白联合红花注射液可升高SOD活力，降低LDH活性、MDA含量和HW/BW%；两者联合可能通过抑制LDH活性和降低MDA水平、增加SOD活力和Klotho浓度对心肌损伤起到协同保护的作用。

Klotho蛋白； 红花注射液； 心肌损伤； 异丙肾上腺素； 小鼠

缺血性心脏病(ischemia heart disease，IHD)是危害人类健康的主要疾病之一。目前用于防治心肌缺血损伤的药物众多。近年来一些天然物质保护心肌损伤的研究备受关注，这源于这些物质具备安全无毒的优点，副作用小的特性。红花是心血管疾病研究领域极具开发前景的天然药物。红花注射液由菊科植物红花提取制备，含较多黄酮类化合物，主要成分为红花黄色素，从中医角度讲，红花注射液具有活血化瘀、通经止痛的作用[1]，从西医角度讲红花黄色素抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集作用，有防止血栓形成和发展或促进血栓溶解的作用，其能增加离体心脏冠状动脉血流量，保护缺血心肌，降低心肌耗氧量，具有较强的抗心肌缺血作用和抗血小板聚集对抗自由基损伤作用[2,12]，降低氧化应激损伤指标[13]。已有研究资料表明，心肌损伤程度及概率与衰老因素有关[3，4]。Klotho基因是新近发现的独立的抗衰老基因[5]，通过基因表达，产生膜结合受体和体液调节因子两种蛋白物质。研究表明，Klotho基因具有的抗氧化应激、保护血管内皮细胞、影响细胞信号转导通路[6]等作用均可针对心血管疾病的发病机制起到防治作用。本研究拟应用ISO诱导构建小鼠心肌损伤模型，通过计算心脏质量指数百分比(HW/BW%)，测定血清乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、血清Klotho浓度，心肌组织石蜡包埋行HE染色、Massion染色、Caspase 3染色的方法，观察Klotho蛋白与红花注射液联合应用对心肌损伤的保护作用，为药物联合应用治疗心肌损伤提供新的思路和参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

异丙肾上腺素注射液(ISO)，上海天丰制药厂，批号991011。盐酸曲美他嗪(施维雅天津制药有限公司，Batch 2008262)。Klotho蛋白；100 mg Cloud-Clone Corp，美国。Klotho蛋白试剂盒。总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1法)，丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(微板法)；Caspase 3抗体；均由南京建成生物工程研究所提供。电子分析天平(Meilteler，GERMANY)。BX-60光学显微镜(Olympus，JAPAN)。低温离心机(美国Eppendorf 5415R)。分光光度计(德国FLUOstar OPTIMA)。

1.2 实验动物及分组

6-7周龄SPF近交系BALB/c小鼠60只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，生产许可证：SYXK(陕)2016-003。实验动物随机分为5组，每组12只。NS组：背部皮下注射0.9%氯化钠10 ml/(kg·d)+腹腔注射0.9%氯化钠10 ml/(kg·d)。ISO组：背部皮下注射ISO 5 mg/(kg·d)，腹腔注射0.9%氯化钠注射液10 ml/(kg·d)。H组：ISO注射同ISO组，腹腔注射红花注射液10 ml/(kg·d)。KL组：ISO注射同ISO组，腹腔注射Klotho蛋白0.01 mg/(kg·d)。KL+H组：ISO注射同ISO组，腹腔注射Klotho蛋白0.01 mg/(kg·d)+红花注射液10 ml/(kg·d)。以上治疗均从实验第1天开始，1次/d,共9 d。

1.3 样本采集与处理

实验第10天称重小鼠，4%水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球采血，常规分离血清，-20 ℃保存，用于检测血清乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、血清Klotho浓度。采血后，立即处死小鼠，快速取出心脏，剪去心脏周围组织和血管，生理盐水冲洗，用滤纸吸干残余液体，称全心重(heart weight,HW)，计算心脏质量指数(HW/BW)。4%多聚甲醛固定心脏，常规石蜡切片(4 μm)。分别用HE染色观察心肌的形态改变，Masson染色观察胶原容积含量变化，Caspase 3染色检测细胞凋亡。

1.4 血清Klotho蛋白浓度的测定

血清KLotho蛋白采用酶联免疫吸附试剂盒测定，在450 nm波长下于酶标仪中测定样本吸光度，据标准品吸光度及浓度绘制标准曲线，根据标准曲线计算出各样本浓度。

1.5 血清乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定

按试剂盒操作说明测定血清LDH、MDA、SOD活力值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 动物模型的建立

本研究采用经典的ISO诱导小鼠急性心肌损伤实验模型。为评估实验模型的有效性，实验中引入HW/BW、乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力的检测指标，并设立对照组，ISO模型组与NS对照组均行HE染色、Masson染色。与NS组比较，ISO组HW/BW、乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量均显著增加(P<0.01)，SOD活力显著减低(P<0.01，见表1)。HE染色结果发现持续的皮下注射ISO(9 d)可引起心肌细胞的肥大以及肌纤维排列的紊乱(见图1)；Masson染色发现ISO 可显著增加心肌间质及血管壁周围的胶原蛋白含量，引起心肌间质纤维化(见图2)。说明实验模型建立成功。

2.2 各组HW/BW%、SOD活力、LDH活性、MDA含量及Klotho浓度变化

KL组、H组、联合组HW/BW、LDH活性、MDA含量显著低于ISO组，SOD活力及Klotho浓度显著高于ISO组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01，见表2)。

表1 两组HW/BW、SOD活力、LDH活性、MDA含量比较

Table 1 Comparison of HW/BW,SOD activity,LDH activity,MDA content between the two groups

组别HW/BWSOD活力(U/ml)LDH活性(U/L)MDA含量(nmol/ml)NS组0．42±0．0220．86±5．807009．90±2427．184．51±2．87ISO组0．50±0．02∗∗14．43±2．02∗∗15834．98±2372．68∗∗11．52±7．27∗∗

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

图1 HE染色两组心肌结构比较 (×400)Figure 1 HE dyeing of cardiac structures in two groups (×400)

图2 Masson染色两组心肌结构改变 (×400)Figure 2 Masson staining of cardiac structures in two groups (×400)

表2 各组HW/BW、SOD活力、LDH活性、MDA含量、Klotho浓度比较

Table 2 Comparison of HW/BW,SOD activity,LDH activity,MDA content between four groups

组别HW/BWSOD活力(U/ml)LDH活性(U/L)MDA含量(nmol/ml)Klotho浓度(pg/ml)ISO组0．50±0．0214．43±2．0215834．98±2372．6811．52±7．72174．19±180．42KL组0．45±0．01∗∗25．20±5．69∗∗10036．30±1616．01∗∗4．66±2．73∗∗384．93±208．25∗∗H组0．47±0．02∗∗20．46±3．52∗∗8033．00±2072．10∗∗6．35±1．83∗∗276．41±114．15∗∗KL+H组0．44±0．04∗∗##25．90±4．31∗∗##9336．63±1236．66∗∗##3．59±2．99∗∗#413．52±123．58∗∗#

与ISO组比较，*P<0.05,**P<0.01；与H组比较#P<0.05,##P<0.01

2.3 Klotho蛋白和红花单用及联合对心肌组织HE染色及Masson染色的影响

HE染色结果显示：ISO组小鼠心肌细胞横径明显大于各治疗组，伴随着肌纤维紊乱和心肌间质成纤维细胞增生；Masson染色结果显示，ISO组小鼠心肌间质及血管壁有大量胶原纤维分布，而治疗组小鼠的心肌间质及血管壁胶原纤维数量较ISO组明显减少(见图3)。

2.4 Klotho蛋白和红花单用及联合对Caspase 3染色的影响

Caspase 3染色结果显示：各治疗组棕黄色染色颗粒分布较ISO组明显减少。染色阳性结果表现为胞质中有大量棕黄色染色颗粒分布(见图4)。

3 讨论

图4 各组对心肌组织Caspase 3染色 (×400)Figure 4 Caspase 3 dyeing of myocardial tissue (×400)

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。通过注射ISO诱发小鼠急性心肌缺血损伤模型是研究抗心肌缺血药物的经典模型[7]。

机体急性心肌缺血造成的心肌组织损伤使心肌细胞、内皮细胞中的LDH 泄漏到血液中，因此心肌酶LDH被认为是心肌细胞受损程度的重要标志酶[8]。本研究结果显示，心肌损伤小鼠给予Klotho蛋白及红花注射液能显著地降低血清中LDH活力，说明Klotho蛋白及红花注射液能改善缺血心肌组织受损程度。MDA系自由基的脂质过氧化产物具备很强的生物毒性，可引起组织结构功能损伤，测定血清MDA的水平可反映自由基对生物膜过氧化损伤的严重程度[9,10]。SOD是能够清除氧自由基的酶，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，测定 SOD的高低可间接反应机体氧化损伤的程度和清除氧自由基的能力[11]。实验结果提示：心肌损伤小鼠给予Klotho蛋白及红花注射液能使SOD 活力上升，并且显著地降低了血清MDA 含量，这说明Klotho蛋白及红花注射液能改善急性心肌缺血小鼠心肌组织的氧化损伤。

心肌缺血最终造成心肌组织损伤通过病理切片可以直观地观察到组织损伤的程度。HE染色结果表明，重组 Klotho 蛋白、红花注射液单用及合用均可抑制ISO诱导的小鼠心脏组织的病理变化。NS组心肌纤维走形正常；而ISO注射之后小鼠心脏组织的 HE 染色表现为心肌纤维走形紊乱、间质成纤维细胞显著增生，表现为细胞核密度的增加以及单核细胞局限性浸润，提示ISO 组中严重的心肌损伤；而治疗组可以改善上述改变。Masson染色结果表明，心肌间质及血管周的胶原纤维含量明显高于对照组，而治疗组可抑制胶原纤维的增加。Caspase 3染色结果表明ISO注射后，心肌细胞的凋亡显著增加，而治疗组可改善ISO诱导的小鼠心肌细胞的凋亡。研究表明Klotho蛋白及红花注射液单用、合用均能改善急性心肌缺血造成的病理性损伤。

综上所述，Klotho蛋白联合红花注射液主要通过对抗氧自由基、拮抗心肌过氧化损伤来发挥对ISO致小鼠心肌缺血损伤的保护作用。

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Protective effect of Klotho protein combined with safflower injection on myocardial injury in mice

FAN Rong1，2, SU Xianming1*, ZHENG Ernü1

(1DepartmentofGeriatricCardiology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China；2141thHospitalofXi’an:*Correspondingauthor,E-mail:suxianming2011@163.com)

ObjectiveTo explore the protective effect of Klotho protein combined with safflower injection on isoproterenol-induced myocardial injury in mice.MethodsThe myocardial ischemia injury model was induced by injecting isoproterenol(ISO) in mice. Sixty 6-7-week-old mice were randomly divided into five groups as follow: 0.9% sodium chloride solution(NS)group, ISO group, Klotho(KL) group, safflower(H)group and KL+H group. The cardiac index(HW/BW%) was calculated, serum lactate dehydrogenase(LDH) activity was measured by enzyme standard method, the level of malondialdehyde(MDA) was detected by thiobarbituric acid method(TBA), superoxide dismutase(SOD) activity was determined by WST-1 method, and the concentration of serum Klotho was measured by ELSIA.The cardiac muscular tissue was imbedded with paraffin and stained with HE, Massion and Caspase 3, respectively.ResultsCompared with NS group, HW/BW%,LDH activity,MDA level were significantly increased in ISO group(P<0.01), and SOD activity was significantly decreased(P<0.01). HW/BW%, LDH activity and MDA level in KL group, H group and in KL+H group were significantly lower than in ISO group(P<0.01), while concentrations of SOD and Klotho were significantly higher(P<0.01). HW/BW, LDH activity in KL+H group were significantly lower than in H group(P<0.01), MDA level was also significantly lower(P<0.05), while SOD activity was significantly higher than in H group(P<0.01), and the concentration of Klotho was also significantly higher(P<0.05).HE staining results showed that the myocardial cell diameter in ISO group was bigger than in NS group, accompanied by disordered muscle fibers and hyperplastic myocardial interstitial fibroblasts. The cardiomyocytes diameters in treatment groups were much smaller than in ISO group. Masson staining results showed that there was a lot of collagen fiber distribution in the myocardial interstitial and hemal walls in ISO group, but they were significantly decreased in treatment groups. Caspase 3 dyeing results showed that the tan dyeing numbers in treatment group were significantly less than in ISO group. Staining positive results were large brownish yellow dye in kytoplasm.ConclusionKlotho protein combined with safflower injection may protect from myocardial injury by inhibiting LDH activity and decreasing MDA level, increasing SOD activity and concentration of Klotho.

Klotho protein; safflower injection; myocardial injury; isoproterenol; mice

陕西省自然科学基金资助项目(2016JM8082)

樊蓉，女，1987-04生，在读硕士，住院医师，E-mail：284111962@qq.com

2016-10-28

R362

A

1007-6611(2017)02-0101-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.002