食管鳞状细胞癌中HER-2基因扩增和蛋白表达

黄 洁，蒋冬先，侯英勇，纪 元，徐 晨，刘亚岚，刘 佳，宿杰阿克苏

食管鳞状细胞癌中HER-2基因扩增和蛋白表达

黄 洁，蒋冬先，侯英勇，纪 元，徐 晨，刘亚岚，刘 佳，宿杰阿克苏

目的 探讨食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中HER-2基因扩增和蛋白表达状况以及与临床病理指标的关系。方法 收集96例ESCC组织，采用免疫组化法检测HER-2蛋白表达，采用FISH法检测HER-2基因扩增，并对患者进行随访。结果 免疫组化结果显示3例HER-2呈3+，15例2+，11例1+，67例 -，3+的病例中2例HER-2基因扩增，15例2+的病例中1例拷贝数>6.0。HER-2蛋白过表达与基因扩增存在显著相关性(P<0.000 1)。HER-2基因扩增/蛋白过表达与肿瘤组织无坏死(P=0.012)、低临床分期(P=0.040)存在一定相关性。HER-2基因扩增/蛋白过表达患者呈预后好的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HER-2在ESCC中有一定的基因扩增率和蛋白过表达率，两者具有相关性，且HER-2基因/蛋白过表达是潜在预后好的指标。

食管肿瘤；鳞状细胞癌；免疫组织化学；荧光原位杂交；HER-2

食管癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一。我国是食管癌发病率和病死率最高的国家，占全球的50%以上，并且约90%为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)，这一点不同于西方国家以腺癌为主的情况[1]。随着个体化医疗时代的到来，HER-2已成为研究热点。在乳腺癌中，HER-2基因扩增不仅提示以HER-2抗原为靶点的曲妥珠单抗治疗有效，而且与患者预后差相关[2-3]。而胃癌中，HER-2阳性仅提示曲妥珠单抗治疗有效，与患者预后关系尚不明确[4-5]。在ESCC中，HER-2方面的研究相对较少[6]。为此，本实验观察了一组国人ESCC中HER-2基因扩增和蛋白表达状况，并分析其与临床病理特征的关系，旨在为临床预后评估和药物靶向治疗方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2010年3月～9月在复旦大学附属中山医院行手术切除术的ESCC标本96例。所有患者术前均未行任何放疗、化疗或其他抗癌治疗，患者行食管癌根治术。所有患者或家属均签订书面知情同意协议，并获复旦大学附属中山医院医学伦理会批准。

1.2 方法 肿瘤切除标本均在术后30 min内用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，制作组织芯片(tissue microarray, TMA)，4 μm厚连续切片，分别行HE染色、免疫组织化学染色(immunohistochemistry, IHC)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测。

1.2.1 IHC 切片脱蜡至水。110 ℃抗原修复液(S2367，Dako公司)中5 min，室温冷却，3%过氧化氢(S2023，Dako公司)阻断内源性过氧化物酶活性，HER-2抗体(Herceptest，Dako公司)室温孵育30 min，EnVision二抗室温孵育30 min，DAB(K3468，Dako公司)显色10 min，苏木精对比染色，常规脱水、透明、封片，同时设置了阳性对照、阴性对照和空白对照。使用的冲洗液均为常温TBST。

结果判定：采用双盲法，由两位经验丰富的病理科医师对免疫组化结果进行判读，IHC得分标准参照霍夫曼对人类胃癌的评分标准：无阳性染色或<10%肿瘤细胞膜染色为0；≥10%肿瘤细胞膜弱染色为1+；≥10%肿瘤细胞由弱到中度的基底侧膜、侧膜或完全性膜染色为2+；由于TMA中肿瘤组织是依照活检样本，中度到强的膜染色均为3+。

1.2.2 FISH检测 HER-2 DNA探针试剂盒购自Vysis PathVysion公司，标本预处理程序及杂交仪变性杂交严格按照说明书进行。经过预处理，10 μL探针覆盖到每个TMA切面，加盖玻片，橡皮胶 (Mpbio, Cat #11FIXO0125) 封边，避免在变性杂交期间探针蒸发。设置杂交仪条件：85 ℃共变性5 min；37 ℃孵育过夜。杂交后洗脱探针，72 ℃ 0.3%NP40/2×SSC缓冲液中放置2 min，然后按顺序脱水：70%、85%和100%乙醇，避光晾干。DAPI复染，-20 ℃冰箱内避光保存。为长期保存还可以用中性树胶将加盖的盖玻片四周密封，防止反复观察移动盖玻片。在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察。

结果判定：选择细胞核大小一致、边界完整、无重叠，标记HER-2基因的红色信号和标记该基因所在的第17号染色体着丝粒(CEP17)的绿色信号清晰的肿瘤细胞，随机计数至少50个细胞核中双色信号。判读标准：HER-2/CEP17比值<2.0，且平均HER-2拷贝数/细胞<4.0时提示无扩增；HER-2/CEP17比值≥2.0提示基因扩增或者HER-2/CEP17比值<2.0，但平均HER-2拷贝数/细胞时>6.0时也提示基因扩增；若众多信号连接成簇时可不计算即视作基因扩增；若HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷贝数/细胞<6.0，但≥4.0，则需再计算50个细胞核中的信号或由另外一个分析者重新计数。

1.3 随访 96例患者的随访资料由临床医师或者患者和家属提供。截止随访日期为2013年4月22日。无病生存期(disease free survival, DFS)和总体生存期(overall survival, OS)是从手术时间到首次复发时间(最后随访时间)或死亡时间计算。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料间的比较用χ2检验及Fisher确切概率检验，生存期估计用Kaplan-Meier分析，生存期间的比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征 本组96例均经病理证实为ESCC。其中男性16例，女性80例，手术时平均年龄62岁(37～81岁)，35例患者<60岁，61例>60岁。32例有吸烟史，27例有饮酒史。食管病变位置：上段1例，中段33例，下段62例。肿瘤组织学分级：2级61例，3级35例。5例肿瘤细胞侵及黏膜下层，24例侵及固有层，67例侵及外膜。34例神经浸润，19例血管浸润，58例出现凝固性坏死，45例发生淋巴结转移。临床分期：ⅠB期4例，ⅡA期29例，ⅡB期23例，ⅢA期20例，ⅢB期17例，ⅢC期3例。

2.2 IHC检测HER-2蛋白表达 HER-2阳性信号呈黄色和棕黄色，定位于细胞膜。96例中，3例HER-2蛋白表达3+，15例2+，11例1+，67例 -(图1)。

ABCD

图1 免疫组化法检测HER-2蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达：A.-；B.1+；C.2+；D.3+，EnVision法

2.3 FISH检测HER-2基因扩增结果 96例中，2例HER-2基因红色信号总数与CEP17绿色信号总数比值>2.0(图2A)，1例HER-2基因平均拷贝数>6.0(图2B)。因此，共有3例HER-2基因扩增。

2.4 HER-2基因扩增与蛋白过表达之间的关系 3例HER-2蛋白表达3+的病例中2例HER-2基因扩增，1例无扩增(图2C)。15例HER-2蛋白表达2+的病例中1例HER-2基因平均拷贝数>6.0。11例HER-2蛋白表达1+和67例-的病例中HER-2基因无扩增(图2D)。HER-2基因扩增和蛋白过表达之间存在显著相关性(P<0.000 1)。

2.5 ESCC患者HER-2基因扩增和蛋白表达3+与临床病理特征的关系 本实验发现HER-2基因扩增和蛋白表达3+与一些传统认为预示预后良好的指标有相关性，如无神经浸润(P=0.013)、无肿瘤组织(P=0.012)、无淋巴结转移(P=0.060)、低临床分期(P=0.040)。另外，HER-2基因扩增和蛋白表达3+均发生于高龄患者(≥60岁)。

2.6 随访 96例患者中有1例失去联系；37例发生肿瘤复发及淋巴结、肝脏和骨转移，DFS从1～37个不等，平均29.4个月；32例死亡，其中30例与ESCC相关，OS从1～37个不等，平均31.9个月。本组ESCC患者3年DFS和OS发生率分别为60.8%和67.0%。

ABCD

图2 FISH法检测食管鳞状细胞癌组织中HER-2基因扩增状况：扩增(A)；平均拷贝数>6.0(B)；蛋白表达3+，基因无扩增(C)；无扩增(D)

2.7 HER-2基因扩增/蛋白表达和临床病理特征与患者预后的相关性分析 淋巴结转移和高临床分期与预后不良的DFS和OS相关(P<0.000 1)，有淋巴结转移和临床Ⅲ期患者的DFS和OS明显低于无淋巴结转移和临床Ⅰ、Ⅱ期患者。另外，神经浸润也预示着不良预后(PDFS=0.028；POS=0.013)。其他临床指标与DFS和OS无关(P>0.05)。

HER-2基因扩增/蛋白过表达患者显示预后好的趋势，但差异无统计学意义(PDFS=0.144；POS=0.202)。另外，DFS和OS与HER-2蛋白高表达(3+、2+)和低表达(1+、-)无关(PDFS=0.964，POS=0.728)，与有表达(3+、2+、1+)和无表达(-)也无关(PDFS=0.715，POS=0.999，图3，表1)。

3 讨论

HER-2基因定位于人染色体17q21，编码的HER-2蛋白是表皮生长因子受EGFRs家族中的一员，属于Ⅰ型酪氨酸蛋白激酶(RPTK)受体家族。

表1 HER-2基因扩增/蛋白表达3+与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系

*随访分析中96例患者有1例失去联系

当细胞外相应片段与HER-2结合后可激活细胞内酪氨酸激酶，从而活化其它一系列细胞内信息传递途径[7]。HER-2基因主要在胚胎发育时开始表达，成年后正常组织中可检出少量HER-2的表达。HER-2的分子改变通常是正常基因产物的过表达。HER-2蛋白高表达常见于乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肺癌等，HER-2过表达与抑制凋亡、促增殖、增强肿瘤转移潜能相关，通过诱导血管内皮生长因子的表达，促肿瘤血管形成，与肿瘤侵袭、转移、化疗耐药及预后不良有明显的相关性。高表达的HER-2蛋白会加速细胞的分裂和增殖，最终导致肿瘤增殖和转移[3,7-8]。

图3 Kaplan-Meier分析无病生存期和总体生存期与HER-2基因扩增/蛋白表达的关系

无病生存期(A)和总体生存期(B)与HER-2基因扩增/蛋白表达3+无关(无病生存期P=0.144，总体生存期P=0.202)；无病生存期(C)和总体生存期(D)与HER-2蛋白表达3+、2+和1+、-无关(无病生存期P=0.964，总体生存期P=0.728)，无病生存期(E)和总体生存期(F)与HER-2有表达(3+、2+、1+)和无表达(-)也无关(无病生存期P=0.715，总体生存期P=0.999)

目前FISH和IHC法均为检测HER-2基因过表达状况较为适宜的方法。以往对ESCC的研究多采用免疫组化法检测HER-2蛋白的表达，本实验采用TMA技术，用免疫组化和FISH两种方法分别检测HER-2蛋白表达和基因扩增情况。

文献报道[9-12]，ESCC中HER-2蛋白过表达率为0～64%，HER-2基因扩增率为2%～20%[9-10]。本组实验发现HER-2基因扩增率为3.1%(3/96)，HER-2蛋白过表达率同为3.1%(3/96)；其中3例HER-2蛋白表达3+的病例中，有2例HER-2基因扩增，HER-2蛋白过表达与HER-2基因扩增存在显著相关性(P<0.000 1)，该结果表明HER-2蛋白过表达主要源于基因扩增。

HER-2在乳腺癌中高表达提示患者预后差，表现为疾病自然生存和总生存时间短，并且易复发。在ESCC中HER-2基因扩增和蛋白过表达是否与临床病理特征和预后情况相关，目前尚无确切的说法。Sato-Kuwabara等[10]发现HER-2基因扩增和蛋白表达与临床病理特征、总生存率无关，但与不良预后相关。邓勇军等[13]报道HER-2蛋白在ESCC中的过表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移密切相关，T3+T4肿瘤组织HER-2过表达率明显高于T1，N1过表达率明显高于N0；HER-2基因过表达是影响总生存率，非过表达患者的总生存率明显高于HER-2过表达患者。而Yong等[11]发现HER-2蛋白表达与患者年龄、肿瘤体积和血管神经浸润相关，和疾病DFS和OS无关。

本实验发现HER-2基因扩增/蛋白过表达与部分预后好的临床病理特征相关，如4例HER-2基因扩增/蛋白过表达均发生在无神经、血管浸润，核分裂象少，高分化，无坏死，无淋巴结转移和低临床分期的ESCC肿瘤组织中，其中与肿瘤组织无坏死(P=0.012)、低临床分期(P=0.040)显著相关，而肿瘤组织无坏死、低临床分期、无神经和血管浸润等指标一般发生于癌症的早期阶段，揭示了HER-2基因扩增伴过表达可能出现在ESCC发生的早期阶段。ESCC的发生、发展是一个多阶段、多因素变化累及的过程，其中涉及HER-2、c-myc、Cyclin D1等多个癌基因和Rb、p53、p16等多个抑癌基因变化[14]。HER-2在ESCC早期阶段如何发挥作用，其机制还需进一步研究。

针对不同研究者研究结果不同的现象，作者推测可能是因为受种族、地域和环境等因素的影响，ESCC的发病原因不尽相同，导致了不同国家甚至不同地区研究结果的差别。值得一提的是，本实验中4例HER-2基因扩增/蛋白高表达均发生于高龄患者(≥60岁)，提示HER-2基因扩增/蛋白高表达与年龄存在一定的关系。

本实验还发现HER-2基因扩增/蛋白高表达与DFS和OS无关，DFS和OS与提示预后差的淋巴结转移、高临床分期和神经浸润等特征相关。与本实验结果相似的是，Al-Momani等[15]也发现中位生存期和2年生存率并不受HER-2过表达影响。一般认为，HER-2基因是一种与肿瘤发生、发展密切相关的原癌基因，参与细胞的生长调控、增殖和分化，其产物过表达能通过启动多种机制包括增强细胞迁移率、体外侵袭力、影响黏附分子合成等机制促进肿瘤的转化，因此常提示恶性程度高，临床预后差。但DFS和OS的影响因素很多，除了本组发现的3个因素外，与患者的后期治疗是否得当也有很大关系。

综上所述，本实验结果提示HER-2在ESCC中有一定的扩增率和过表达率，且HER-2蛋白的过表达主要源于基因扩增。本组资料提示HER-2过表达和扩增与预后的关系尚不明确，需更进一步研究。ESCC中HER-2扩增或过表达是赫赛汀的潜在治疗靶点。

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HER-2 gene amplification and protein expression in esophageal squamous cell carcinoma

HUANG Jie, JIANG Dong-xian, HOU Ying-yong, JI Yuan, XU Chen, LIU Ya-lan, LIU Jia, SU Jieakesu
(DepartmentofPathology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Purpose To explore the status of HER-2 gene amplification and protein expression in Chinese esophageal squamous cell carcinoma patients and its relationship with the clinicopathological parameters. Methods The HER-2 gene amplification was detected by FISH and protein expression by IHC in 96 patients with esophageal squamous cell carcinoma that would be followed up for 3 years. Results Three cases presented with 3+, 15 cases with 2+, 11 cases with 1+, and 67 with negative by HER-2 immunohistochemical staining; 2 of 3 cases presented with HER-2 amplification in in 3+, 1 case presented with over 6 HER-2 copy numbers. HER-2 amplification and HER-2 overexpression had significant correlation (P<0.000 1). HER-2 amplification or overexpression was associated with clinicopathological parameters, such as, carcinomas without necrosis (P=0.012) and lower stage (P=0.040). There was better DFS or OS trend in patients with HER-2 overexpression or amplification, but the significant difference did not reached. Conclusion This research has demonstrated the correspondence between gene amplification and protein overexpression of HER-2 in ESCC. HER-2 gene overexpression or amplification is a potential better predictive parameter in ESCC, but needs further study.

esophageal neoplasms; squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; fluorescence in situ hybridization; HER-2

上海市卫计委薄弱科室资助项目(2015ZB0201)

复旦大学附属中山医院病理科，上海 200032

黄 洁，女，硕士，主管技师。Tel: (021)64041990-2732，E-mail: huangjie1116@163.com 宿杰阿克苏，女，副主任技师，通讯作者。E-mail: 13816327136@126.com

时间：2017-6-20 11:18 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.006.html

R 735.1

A

1001-7399(2017)06-0618-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.006

接受日期：2017-04-14