草地早熟禾的石蜡切片制作技术的优化

陈 阳， 金一锋， 孙华山， 赵春丽， 王 琦， 王玉书

(1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006； 2. 东北农业大学园艺园林学院， 黑龙江 哈尔滨 150030； 3. 福建农林大学园艺植物生物工程研究所， 福建 福州350002)

草地早熟禾(PoapratensisL.)是隶属于禾本科早熟禾属多年生草本植物，其具备抗寒、叶色浓绿、分蘖性强等优势，常用于我国北方住宅区、街道、公园等园林绿化[1-4]。草坪业是耗水耗肥产业，易受外界环境因素影响。草坪草逆境胁迫下的生长形态和生理代谢研究一直是研究重点[5-7]。采用石蜡切片技术观察植物解剖结构已经成为研究植物逆境胁迫后生长形态发育过程的重要手段[8-10]。石蜡切片其快速、便捷、易观察等特点，广泛应用于各植物材料中，但不同植物其组织、器官结构特点不同，使得针对不同植物优化筛选得到适宜的、有针对性的石蜡切片制作过程十分有必要。目前针对草地早熟禾解剖结构的研究集中于研究器官结构、花芽分化，但石蜡切片效果存在器官结构破裂、染色效果不佳、制片模糊不宜观察等情况，针对草地早熟禾的石蜡切片技术优化甚少。本研究以草地早熟禾根、茎、叶为供试器官，对石蜡切片操作过程中的关键因素进行优化，深入探究染色时间处理对石蜡切片效果的影响，以期获取完整的、清晰的、易观察的草地早熟禾解剖结构质，为进一步开展草地早熟禾逆境胁迫后生长形态发育过程的研究提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

供试材料为黑龙江野生草地早熟禾，选取生长两年的植株，取其根、茎、叶三个部位制作成石蜡切片，然后用显微镜观察。

1.2 方法

1.2.1固定与冲洗 采用FAA固定剂对其各部位固定24 h。用50%乙醇(180 ml)+冰醋酸(10 ml)+40%甲醛(10 ml)的FAA固定剂对草地早熟禾根、茎、叶进行固定。用70%乙醇(180 ml)+冰醋酸(10ml)+40%甲醛(10 ml)的FAA固定剂对草地早熟禾各组的根颈、须根进行固定。将经FAA固定的实验材料，用50%或70%(与固定液同浓度)的乙醇冲洗，每次冲洗1～2 h，每20 min晃动一次U形管可以保证冲洗的更彻底，共冲洗3次。

1.2.2脱水 经 70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐级梯度脱水后再用无水乙醇脱水5次(每次 30 min)，乙醇逐级脱水时间进行两组处理：a.70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐级梯度脱水1 h；b.70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐级梯度脱水2 h。

1.2.3透明 采用逐级过渡的方法将材料从乙醇中逐渐过渡到纯二甲苯。其中纯二甲苯更换方式分为两种：a.纯二甲苯更换两次，每次1 h；b.纯二甲苯更换三次，每次0.8 h。透明具体过程：将材料置于2/3乙醇+1/3二甲苯混合后处理1 h，重复3次，再将材料转入转入二甲苯处理1 h或0.8 h(注：1/3、2/3代表体积比)。

1.2.4浸蜡 将试验材料从低温(55℃)到高温(65℃)，从低浓度石蜡(1/2透明剂+1/2石蜡)，共处理9 h转移到纯石蜡中，共浸蜡24 h，期间更换5次纯蜡。

1.2.5包埋、切片、展片及贴片 烘箱调至为70℃包埋，将实验材料插入装有熔化石蜡的方形纸盒中，在石蜡表面凝固前要将所有植物材料迅速插入其中，均匀排布。切片刀口的倾斜角度在5～8度为佳，切片的厚度调整到8 μm为最佳。展片时采用50℃恒温水浴锅展片，展好的片用粘有粘贴剂的载玻片捞出，石蜡切片正好位于载玻片中央且保持完整性。展片后，在工作台上停留片刻使多余的溶液蒸发掉让实验材料紧密的贴在载玻片上，然后等其自然风干(10天左右)。

1.2.6染色与封片 本实验采用番红-固绿染色法，对其染色时间进行了筛选，见表1。草地早熟禾染色过程为：将材料置于二甲苯中处理3 min，重复2次；转入到1/2二甲苯+1/2乙醇中3 min，依次转入到100%、90%、80%、70%乙醇，每次处理2 min；将材料置于番红溶液中数小时，再依次转入到60%、70%、80%的乙醇，每次处理2 min；将材料置于固绿溶液数秒后，转入到乙醇中处理三次，每次2 min，再将材料逐渐过渡到二甲苯中。本实验采用加拿大树胶作为封固剂，将适量的封固剂滴到材料上，最后盖上盖玻片，等其在自然条件风干。

1.2.7观察及测量 石蜡切片制作好后，用显微镜进行观察、测量、记录、拍摄植物各典型结构解剖图。

表1 染色时间的筛选Table 1 Screening of staining time

2 结果与分析

2.1 不同脱水方式对于浸蜡和切片的影响

脱水目的是除净材料中的水分，使材料变硬，形状更稳定，使包埋剂(石蜡)和封固剂(加拿大树胶)渗透到草地早熟禾的各组织中。若脱水不彻底，后续浸蜡时蜡将不能完全渗入植物组织的每一个细胞，导致石蜡切片上的植物材料脱落，形成孔、洞。实验中发现，a组70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐级梯度脱水1 h后，发现脱水不彻底导致了草地早熟禾材料从石蜡切片上脱落下来，而b组逐级梯度脱水2 h后未发生材料脱落现象，效果较好。

2.2 不同透明方式对于切片的影响

本实验中采用逐级过渡方法将草地早熟禾从乙醇中逐渐过渡到纯二甲苯。实验发现：a组纯二甲苯更换两次，每次1 h后，其草地早熟禾组织部位透明不彻底，影响后续染色；b组将纯二甲苯更换三次，每次0.8 h，增加了更换频率，同时减少了每次处理时间，其透明较彻底，效果良好。

2.3 不同染色方式对于切片的影响

本实验采用番红-固绿染色法，进行石蜡切片染色，番红溶液将木质化部分染成红色，固绿溶液将纤维素的细胞壁染成绿色，对于维管束，木质部被染番红溶液成红色，韧皮部被固绿溶液染成绿色。番红和固绿的染色时间对石蜡切片的制作至关重要，不同植物其解剖结构差异较大，需筛选适宜的染色方法，故本实验进行了筛选实验(见表2)，来探索哪种方法对草地早熟禾的石蜡切片的染色效果更好。

表2 番红-固绿染色时间处理下的效果比较Table 2 Comparison of dying effects with Sarranine-Fast green dying times

从表2、图1可以看到，当番红处理同为2h时，固绿溶液仅处理5s时，红色区域较多，其中细胞壁、韧皮部都被染成红色，图像整体呈现红色，结构不易区分。随着固绿溶液处理时间逐渐增多，图像绿色区域随之增加，但是当固绿溶液处理40～120 s时，图像整体呈现绿色，结构不易区分。综合几组实验图像，第4组即番红溶液(3 h)、固绿溶液(40 s)时染色效果更好，红色和绿色部分更明显，更易区分材料横剖面的各组织，能更好的体现番红-固绿双色染色法的价值。

图1 番红-固绿不同染色时间下的染色效果图Fig.1 Comparison of dying effects with Sarranine-Fast green dying times(注：A.番红2 h，固绿5 s ；B.番红2 h，固绿20 s；C.番红2 h，固绿40 s；D.番红3 h，固绿40 s；E.番红2 h，固绿120 s)(Note：A.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 5 s；B.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 20 s；C.Safranin solution dyed 2 h， then fast green 40 s；D.Safranin solution dyed 3 h，then fast green 40 s；E.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 120 s)

3 讨论与结论

本研究通过对草地早熟禾石蜡切片关键步骤进行相应优化，发现不同脱水方式严重影响后续浸蜡的程度，如果脱水不完全，浸蜡不彻底，切片过程中易出现孔、洞，石蜡切片中的器官组织不完整，但有研究发现，过度脱水易造成后续展片不完整，出现褶皱的现象[11]。本试验优化不同透明方式对于切片的影响时，增加的二甲苯更换频率，同时减少了每次更换的时间，可有效使草地早熟禾器官组织中的颜色透明，易于后续染色。有研究发现，同一种植物不同器官或者不同植物中的透明过程有较大差异，如草地早熟禾胚胎结构[11]、苹果花药[12]、马铃薯胚胎[13]、三叶草茎与叶片结构[14,15]等，筛选与优化适宜草地早熟禾根茎叶的透明方式很有必要。本实验筛选染色方式中，进行了传统番红-固绿染色方法的优化，发现针对草地早熟禾染色方法的优化十分必要，若方法不当，易出现维管束内部结构区分不明显、局部颜色过红或过绿，观察效果不好。由于植物之间的结构组织不相同，内部解剖结构存在一定差异，针对特定植物特定位置的染色方法可以利于更好的观察。本研究发现番红3 h，固绿40 s染色处理下表皮、同化组织、维管束结构清晰，红色、绿色的染色效果较好，结构易区分，能较好的观察草地早熟禾根茎叶中的解剖结构，这有利于后续观察草地早熟禾解剖结构与抗逆性的关系、不同时期草地早熟禾形态结构的发育过程等。