人喉鳞状细胞癌中CMIP的表达及意义

韦党军，高潮兵，吴正升

人喉鳞状细胞癌中CMIP的表达及意义

韦党军1,2，高潮兵3，吴正升1

目的 探讨CMIP(C-Maf inducing protein)基因在人喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)和喉息肉组织中的表达及其临床意义。方法 应用实时荧光定量PCR法检测28例人LSCC和23例喉息肉组织中CMIP mRNA的表达；应用免疫组化法检测86例人LSCC和29例喉息肉组织中CMIP蛋白的表达，分析其与LSCC临床病理特征及其预后的关系。结果 LSCC CMIP mRNA和蛋白表达均显著高于喉息肉组织；CMIP表达与LSCC淋巴结转移和临床分期呈显著正相关，并且CMIP表达均与LSCC患者无复发生存期(relapse-free survival, RFS)和总生存期(overall survival, OS)密切相关。结论 CMIP可能参与人LSCC的发生、发展，CMIP表达提高可能是LSCC进展和预后不良的潜在标志物。

喉肿瘤；鳞状细胞癌；CMIP；实时荧光定量PCR；免疫组织化学

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)是人喉部最常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于肺癌，是呼吸系统第二大恶性肿瘤[1]。尽管近年来LSCC的诊疗技术有了一定进展，中晚期LSCC患者的预后仍然不令人满意[2]。另外，一些传统的判定LSCC患者预后的指标，如临床TNM分期和肿瘤淋巴结转移等指标并不能完全准确的评估患者的生存状况和指导后续治疗[3]。因此，探讨人LSCC发生、发展背后的分子机制以及相关重要调控因子，有助于发掘并建立新的有效的判定LSCC患者病情进展和预后生物学标志物，乃至将来对LSCC的分子靶向药物的研发具有重要意义。本文分别使用实时荧光定量PCR和免疫组化法检测LSCC患者新鲜肿瘤组织和石蜡包埋组织(以喉息肉作为对照)中CMIP(C-Maf inducing protein)的表达及其与患者临床病理特征及预后的关系，探讨CMIP作为LSCC病情进展和患者预后判定的一种新的生物学标志物。目前，关于CMIP在人LSCC的研究国内外尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2009～2012年安徽医科大学第一附属医院和太和县中医院病理科存档的86例LSCC和29例喉息肉组织，组织均以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。每例病例诊断均经病理证实。按照美国癌症联合委员会(AJCC)最新分期标准进行临床分期。所有病例均获随访，获得无复发生存期(relapse-free survival, RFS)和总生存期(overall survival, OS)。患者术前均未接受任何放疗或化疗等治疗。另收集2015～2016年安徽医科大学第一附属医院存档的耳鼻喉手术切除的28例LSCC和23例喉息肉组织，标本离体后立即置入液氮保存。所有病例诊断均经病理证实。

1.2 试剂与方法

1.2.1 实时荧光定量PCR Trizol提取液购自Reagent公司，cDNA合成试剂盒购于Takara公司，Ex Tap PCR反应试剂盒购于Takara公司，PCR引物由上海捷瑞公司合成。首先将收集的LSCC和喉息肉新鲜组织按照试剂说明书进行总RNA提取，cDNA合成和定量PCR检测。每个样本分别重复3次，得到扩增曲线和样本的相对定量Ct值。以标本CMIP的Ct值和内部参照GAPDH的Ct值用2-△△Ct法得到每个样本CMIP的mRNA相对表达水平。

1.2.2 免疫组化 鼠抗人CMIP单克隆抗体购自Proteintech公司(工作浓度1 ∶100)，采用免疫组化MaxVision法染色，即用型免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新公司，具体操作按说明书染色步骤进行。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。

1.3 结果判定 CMIP染色以细胞质出现明显的黄色颗粒视为阳性着色，染色标准综合阳性细胞率及染色强度进行评估，判断表达强度：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(1+)，3～4分为中度阳性(2+)，5～6分为强阳性(3+)。阴性和弱阳性视为低表达，中度和强阳性视为高表达。

2 结果

2.1 CMIP在人LSCC和喉息肉组织中的表达 在新鲜样本中，28例LSCC的CMIP mRNA表达量为3.05±1.25，23例喉息肉组织为1.44±0.52，两者之间差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。而CMIP蛋白阳性信号呈黄色颗粒状，主要定位于鳞状细胞癌的细胞质，正常鳞状上皮有少量表达(图2)。86例石蜡包埋LSCC组织中CMIP高表达率为52.3%，29例喉息肉组织高表达率为27.6%，两者之间差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

图1 喉息肉和喉鳞状细胞癌组织中CMIP mRNA的表达

表1 CMIP在人喉鳞状细胞癌和喉息肉中的表达[n(%)]

*P=0.021

AB

图2 CMIP蛋白在喉息肉组织(A)中呈低表达，在喉鳞状细胞癌组织(B)中呈高表达，MaxVision法

2.2 CMIP表达与LSCC临床病理特征的关系 CMIP表达与LSCC淋巴结转移和临床分期呈显著正相关(P<0.05；P<0.01)，与患者年龄、性别、肿瘤位置和组织学分级均无显著相关性(P>0.01，表2)。

表2 CMIP表达与人喉鳞状细胞癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 CMIP表达与LSCC患者预后的关系 为探讨CMIP表达与LSCC患者预后的关系，本实验采用Kaplan-Meier曲线法和Log-rank检验对CMIP蛋白表达及LSCC患者RFS和OS关系进行单因素生存分析。86例具有完整随访资料的LSCC患者，CMIP蛋白表达均与患者RFS和OS密切相关(P均<0.01，图3)。

图3 喉鳞状细胞癌组织中CMIP蛋白表达与患者无复发生存率(A)和总生存率(B)的关系

3 讨论

喉癌是临床耳鼻咽喉头颈外科常见的肿瘤之一，好发于中老年男性，其具体病因尚不十分清楚，可能与患者吸烟、病毒感染和饮酒过多等多种因素有关。近年来，随着我国城市大建设和城镇工业化的影响，大气污染如雾霾等日益加重，可能也是引起喉癌发病率升高的原因之一[4-6]。目前，临床喉癌的治疗主要采取以手术治疗为主的综合治疗，包括手术治疗、化疗、放疗和免疫治疗等。然而，每种治疗均有其优缺点，对于喉癌患者特别是中晚期患者的治疗效果难以达到满意的效果。近年来，随着“个体化治疗”和“精准治疗”等理念的提出，迫切需要开发新的有效的肿瘤生物标志物和药物靶点为不同患者提供最合适的治疗策略[7-8]。因此，认识肿瘤发生、发展和侵袭转移等分子机制，从中发掘重要的调控因子对监测肿瘤病情发展、指导治疗和建立药物靶点有着重要意义。

LSCC是临床实践中喉癌最主要的组织学类型，目前大多数喉癌研究均以其为研究对象，陆续发现了一些LSCC相关的癌基因和抑癌基因。Gao等[9]采用免疫组化法检测76例LSCC和26例喉息肉组织中ARTN基因及其受体GFRα1表达，发现LSCC中ARTN和GFRα1表达显著高于喉息肉组织，并且与肿瘤临床分期和患者预后密切相关。Zhuang等[10]研究发现LSCC组织中CCAT1表达显著高于癌旁组织黏膜组织，并且与肿瘤组织学分级和临床分期密切相关，进一步体外研究发现，高表达CCAT1能够促进LSCC细胞Hep-2的增殖、侵袭和转移，提示CCAT1可能在LSCC发生、发展过程中发挥癌基因角色。孙玉满等[11]应用免疫组化SP法检测85例LSCC及癌旁切缘组织中p53、p21和Cdk1/p34cdc2蛋白表达，发现p53、p21和Cdk1/p34cdc2蛋白在LSCC发生、发展中可能起重要作用，癌旁切缘组织中p53、p21和Cdk1/p34cdc2过表达与LSCC局部复发密切相关，Ge等[12]研究发现miR-300在LSCC组织中表达较癌旁正常组织显著下调，并且过表达miR-300可以显著抑制Hep-2细胞的增殖和侵袭，提示miR-300在LSCC进展中发挥抑癌基因角色。

CMIP是一种衔接蛋白，具有两种亚型：一种亚型是短蛋白，参与多种信号通路，并且在微小病变型肾小球肾炎的发病中发挥重要作用[13-14]；另一种亚型是长蛋白，其功能目前尚不清楚[15-16]。CMIP在人LSCC中角色尚未见报道。本实验首先使用两种技术检测LSCC组织和良性喉息肉组织中CMIP蛋白和mRNA的表达，发现恶性肿瘤组织中CMIP蛋白和mRNA表达均较良性病变组织显著提高。进一步通过临床病理特征分析发现，CMIP表达与肿瘤淋巴结转移和临床分期呈正相关，并且与LSCC患者RFS和OS呈负相关，提示CMIP在LSCC发生、发展中可能发挥癌基因角色。

综上所述，本实验通过检测临床LSCC组织和喉息肉组织样本中CMIP的表达，发现CMIP表达量与患者病情进展和术后生存期密切相关，提示CMIP可能参与LSCC发生、发展，其表达量可能是预测病情进展和患者预后的生物学指标。

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Clinical significance of CMIP expression in human laryngeal squamous cell carcinoma

WEI Dang-jun1,2, GAO Chao-bing3, WU Zheng-sheng1
(1DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,TaiheHospitalofTraditionalChineseMedicine,Fuyang236600,China;3DepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,FirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To investigate the expression of C-Maf inducing protein(CMIP) in human laryngeal squamous cell carcinoma and polyps tissues, and to analyze their association with clinicopathological parameters and survival of patients with laryngeal squamous cell carcinoma. Methods Real-time PCR assay was used to detect the expression of CMIP mRNA in 28 cases of laryngeal squamous cell carcinoma and 23 cases of polyp fresh tissue specimen. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of CMIP in 86 cases of formalin-fixed and parrffin-embedded laryngeal squamous cell carcinoma and 29 cases of polyp tissue specimens. The clinicopathological and prognostic significance of CMIP expression was investigated in laryngeal squamous cell carcinoma. Results The expression of CMIP mRNA and protein was both significantly increased in laryngeal squamous cell carcinoma compared with polyp tissue specimens. The expression of CMIP was significantly associated with tumor lymph node metastasis and late clinical stage of laryngeal squamous cell carcinoma. Furthermore, the expression of CMIP was significantly correlated with poor relapse-free survival and overall survival in laryngeal squamous cell carcinoma. Conclusion CMIP might play an important role in the development and progression of laryngeal squamous cell carcinoma and increased expression of CMIP might imply disease progression and poor outcome in patient with laryngeal squamous cell carcinoma.

laryngeal neoplasms; squamous cell carcinoma; C-Maf inducing protein; Real-time PCR; immunohistochemistry

安徽省学术和技术带头人及后备人选科研基金资助项目(2016H074)、安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目(gxyqZD2016046)

1安徽医科大学病理学教研室，合肥 2300322安徽省阜阳市太和县中医院耳鼻喉科，阜阳 2366003安徽医科大学第一附属医院耳鼻喉科，合肥 230032

韦党军，男，硕士研究生。Tel: (0551)62922025，E-mail: 13966591297@163.com 吴正升，男，博士，教授，通讯作者。E-mail: woozson@126.com

时间：2017-6-20 11:18 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.012.html

R 739.6

A

1001-7399(2017)06-0649-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.012

接受日期：2017-02-14