丹参愈伤组织快速生长培养方法

刘慧敏+刘艳军+黄俊轩+杨静慧+李建科+严小峰+武春霞

摘 要：为了建立丹参愈伤组织快速生长培养体系，采用丹参绿色、松散愈伤组织为外植体，通过不同培养基、不同培养温度和不同继代时愈伤组织块的大小等条件的改变，找到生长最快、结构、质地良好的丹参愈伤组织培养条件。结果显示，在MS+0.5 mg·L-1BA+1 mg·L-12，4-D+100 mg·L-1Vc的培养基上，培养温度为22 ℃，接种外植体直径大小为0.5 cm时，愈伤组织生长速度最快，愈伤组织质量最好。本试验结果为丹参生物制药研究奠定了基础。

关键词：丹参；愈伤组织；继代培养；生物制药

中图分类号：S576.5+3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.004

Study on Rapid Growth Method of Salvia miltiorrhiza Callus

LIU Huimin， LIU Yanjun， HUANG Junxuan， YANG Jinghui， LI Jianke， YAN Xiaofeng， WU Chunxia

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： In order to establish the rapid growth system of Salvia miltiorrhiza callus， the green and loose callus of Salvia miltiorrhiza were used as explants. The culture conditions in which rapid growth and loose callus of Salvia miltiorrhiza could be induced were found through different media， different culture temperature and the size of callus tubers. The results showed that on MS+0.5 mg·L-1BA+1 mg·L-12，4-D+100 mg·L-1Vc medium， when the culture temperature was 22 ℃， the callus growth was the fastest， and the callus quality was best. The results laid the foundation for the study of Salvia miltiorrhiza biological pharmaceutical.

Key words： Salvia miltiorrhiza； callus； subculture； biological pharmaceutical

通过组织培养技术进行药物成分的生产是一种重要的生物制药途径[1-2]。其中利用愈伤组织进行药物有效成分的生产是一种最为普遍的技术手段，目前，已经在多种植物上获得了成功。由于丹参药用价值高、市场需求量大但栽培技术落后，所以丹参的组织培养技术受到很大重视。利用丹参愈伤组织扩繁、悬浮细胞培养及毛状根培养等技术进行有效成分的生产已经取得显著的研究成果[3-7]。

采用愈伤组织为培养材料进行药物有效成分生产技术关键，一是愈伤组织中有效成分的含量，二是愈伤组织的生长速度。前者主要取决于愈伤组织遗传特性，而后者主要取决于培养条件。好的培养条件是利用组培技术进行生物制药成功的关键。本研究以丹参愈伤组织为试材，采用不同的培养基、培养温度和培养方式，寻找其愈伤组织快速生长的最佳条件，以为丹参等中药植物的生物制药提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本试验中所用的松散型丹参愈伤组织由天津农学院园林植物实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 丹参愈伤组织的准备 取丹参愈伤组织在超净台中用解剖刀切成直径0.5 cm大小的小块，将其接种到事先配制好的MS+0.5 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12，4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上进行增殖培养。经过大约30 d的培养，愈伤组织长到原来接种外植体大小的3倍左右。将愈伤组织继续切成小块备用。

1.2.2 不同培养基对丹参愈伤组织生长速度的影响 将步骤1.2.1中获得的丹参愈伤组织在超净台中用解剖刀切成直径0.5 cm的小块，将其接种到事先配制好的培养基中。这些培养基分别含有不同种类和浓度的植物激素，同时通过调整培养基中蔗糖的用量来改变其渗透压。在培养基中加入7 g·L-1琼脂粉作为凝固剂，在121 ℃下灭菌20 min，所有容器均为100 mL三角瓶，每个三角瓶中加入30 mL培养基。为了防止丹参愈伤组织出现褐变，在其中加入100 mg·L-1的Vc作为还原剂。每个处理做5个三角瓶重复，每瓶加入外植体10块。接种后将三角瓶放到培养室中进行愈伤组织的培养，培养条件为25 ℃，24 h连续光照，光照强度为2 000 lx。经过大约30 d的培养，對三角瓶中丹参愈伤组织的生长情况进行观察统计，寻找最佳的培养基组合。

1.2.3 不同培养温度对丹参愈伤组织生长速度的影响 将步骤1.2.1中获得的丹参愈伤组织切成步骤1.2.2中的大小，采用上一步骤中筛选出的生长效果最好的培养基进行接种。采用相同的操作，培养条件都相同，只是设置不同的培养温度。设置20，22，24，26，28 ℃共5种不同培养温度。将接种好的三角瓶放置到上述培养温度下。经过大约30 d的培养，对三角瓶中丹参愈伤组织的生长情况进行观察统计，从中找到最佳的培养温度。

1.2.4 不同继代时愈伤组织块的大小对丹参愈伤组织生长速度的影响 再次重复以上试验步骤，将愈伤组织切成直径不等的小块，大致分为0.2，0.5，1.0 cm左右3种大小的小块，将其接种到事先配制好的培养基上，在步骤1.2.3中筛选出的温度下进行培养。经过大约30 d的培养后，对三角瓶中丹参愈伤组织的生长情况进行观察统计，并从中找到最佳的外植体大小。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对丹参愈伤组织生长速度的影响

经过30 d培养后，在不同培养基上愈伤组织出现差异显著的变化，具体情况见表1。

从表1可以看出，在不同培养基上，丹参愈伤组织的生长情况各不相同。首先，从增长速度上看，在较高的2，4-D作用下愈伤组织生长速度明显增大，表中数据为平均估算值，因为测量存在较大的误差，但总的来看还是差异较大。比较BA使用浓度对愈伤组织生长的影响可以看出，使用0.5 mg·L-1的效果要好于1.0 mg·L-1，这说明，BA不利于愈伤组织快速增长。其次，从愈伤组织结构与颜色变化来看，2，4-D浓度较大时，愈伤组织容易变得松软，颜色也变浅，这说明是愈伤组织细胞增大造成的结果；相反，高浓度BA会促进细胞的分裂，细胞密度增大，愈伤组织质地相应变得紧密，颜色也变得较深。此外，本试验还考虑改变渗透压，但其对生长素影响不大，只是会使得愈伤组织质地变软。在较高的BA/2，4-D的处理中出现少数愈伤组织死亡或停止生长的现象，这说明BA对愈伤组织有一定的毒害作用，应适当降低其使用浓度。综上所述，理想的丹参愈伤组织快速生长的培养基配方是：MS+0.5 mg·L-1BA+1 mg·L-12，4-D+100 mg·L-1Vc+30 g·L-1蔗糖。

2.2 不同培养温度对丹参愈伤组织生长速度的影响

丹参愈伤组织在不同温度下生长情况不同，接种初期变化不大，但在培养30 d后出现明显的不同，有的停止生长，有的增长显著，具体情况见表2。

从表2可以看出，不同温度对丹参愈伤组织生长影响较大。首先，在较低温度下，丹参愈伤组织生长速度较快，这与一般植物不同，一般植物在25 ℃以下生长缓慢，最适温度为28 ℃左右。而丹参在22 ℃生长速度最快，这说明其适合低温培养。另外，从愈伤组织的特性变化来看，在低温条件下基本不变，而且也没有出现死亡的愈伤组织，这对于快速培养愈伤组织十分有利。其次，随着温度的提高，丹参愈伤组织生长速度降低，从愈伤组织的颜色和质地变化可以分析出其中的原因。在较高的培养条件下，愈伤组织出现玻璃化现象，因此，愈伤组织生长速度下降，颜色变成深绿色，并随着培养时间的延长逐渐出现死亡现象。这些都说明丹参愈伤组织不适应高温生长。综上所述，丹参愈伤组织快速培养的最佳温度条件为22 ℃。

2.3 不同继代时愈伤组织块的大小对丹参愈伤组织生长速度的影响

经过30 d的培养，每种处理的结果都不相同，具体情况见表3。

从表3可以看出，接种时外植体的大小对愈伤组织生长速度与质量都产生较大的影响。首先，在外植体大小为0.2 cm时，愈伤组织生长速度较慢，而且愈伤组织质地变硬，并且出现较高的死亡率，这些说明较小的外植体在初步接种到培养基上短时间内不适应新的环境而生长受到抑制。因此，过于小的外植体并不能获得理想的生长速度。其次，在采用较大外植体时，由于外植体生长空间的限制，在外植体的边缘愈伤组织较为活跃，但从整体的愈伤组织生长速度来看却明显下降，与0.5 cm的相比，生长速度下降近一倍。因此，适宜的外植体大小对于愈伤组织生长影响较大。根据试验结果，理想的丹参愈伤组织接种大小应为0.5 cm，这时愈伤组织生长速度最快，愈伤组织质量不变。

3 结 论

本研究以丹参愈伤组织为外植体，讨论了培养温度、激素种类和外植体大小对愈伤组织生长速度的影响，总结出了以下一套培养方法：取提前誘导好的松散型丹参愈伤组织在超净台中用解剖刀切成直径0.5 cm大小的小块，将其接种到事先配制好的MS+0.5 mg·L-1BA+1.0 mg·L-12，4-D+100 mg·L-1Vc +30 g·L-1蔗糖的培养基上进行增殖培养。培养条件为22 ℃，24 h连续光照，光照强度为2 000 lx。本试验结果可以为丹参等中药植物的生物制药提供参考。

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