响应面法优化花椒籽仁蛋白质盐提工艺条件

李 超，蒲 彪，刘兴艳，徐丹萍，罗松明，王春霞，蒋培基，潘姝璇，李 强，付本宁

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安 625014)

油料蛋白

响应面法优化花椒籽仁蛋白质盐提工艺条件

李 超，蒲 彪，刘兴艳，徐丹萍，罗松明，王春霞，蒋培基，潘姝璇，李 强，付本宁

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安 625014)

采用盐提法提取花椒籽仁中蛋白质，探讨提取时间、料液比、NaCl浓度、提取温度、提取pH对蛋白质提取率的影响。在单因素试验的基础上，通过响应面试验优化花椒籽仁蛋白质提取最佳工艺条件。结果表明：固定提取pH为11，其他各因素对花椒籽仁蛋白质提取率的影响次序依次为提取时间>提取温度>料液比>NaCl浓度；最佳提取工艺条件为提取pH 11、提取时间35 min、提取温度50℃、料液比1∶21、NaCl浓度1.2 mol/L；在最佳提取条件下，花椒籽仁蛋白质提取率达到 88.77%，所得蛋白质含量达到93.17%。

花椒籽仁蛋白质；盐提法；响应面

花椒籽，中医名椒目，多数为球形，粒径3.5～4.0 mm，千粒重12.5～22.0 g[1]，目前被认为是良好的油料资源之一[2-3]，可分为籽皮与籽仁两部分。以花椒籽仁为原料制得花椒籽仁油不饱和脂肪酸含量高达90%，主要含油酸、亚油酸、亚麻酸，其中亚麻酸的含量可达到40%以上[4-5]，此外花椒籽仁油还含有多种挥发性成分[6]以及丰富的Ca、Mg、Fe、Zn及含量较高的Sr、Mn 等人体必需的矿质元素[7-8]，具有良好的开发前景。因此，诸多研究者以花椒籽仁为原料制备高营养的保健食用油[9-12]。然而提取油脂后的花椒籽仁残渣大部分作为肥料甚至被当作废料丢弃。研究表明脱脂后的花椒籽仁粗蛋白质含量高达60.34%，高于花生[13]、油菜籽[14]等。而且其氨基酸组成较为全面，含有人体必需的8种氨基酸[15]，是一种优质的蛋白质，可供进一步开发利用。

有关花椒籽仁蛋白质提取工艺的研究较少，杨令叶[15]对比了碱溶酸沉法和盐提法提取花椒籽仁蛋白质，结果发现采用盐提法提取花椒籽仁蛋白质效果较好。本试验在前人研究的基础上，以花椒籽仁为原料，通过单因素试验和响应面设计优化盐提法提取花椒籽仁蛋白质的工艺条件，以期为花椒籽仁蛋白质的开发利用提供理论指导，拓宽花椒籽的应用范围。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

花椒籽，由四川省洪雅县幺麻子食品有限公司提供；考马斯亮蓝试剂盒，南京建成生物工程研究所；石油醚、氢氧化钠、氯化钠、醋酸等均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

101-OBS型电热鼓风干燥箱，邦西仪器科技(上海)有限公司；FW-400A万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；KDN-C型凯氏定氮仪，上海新嘉电子有限公司；ZD-85型气浴恒温振荡器，金坛市科析仪器有限公司；MICROMAX型高速离心机，美国Thermo公司；Varionskan flash型全波长酶标仪，美国Thermo fisher公司。

1.2 试验方法

1.2.1 花椒籽仁脱脂粉的制备

(1)花椒籽经过粉碎破壳，筛选出花椒籽仁，粉碎，过40目筛。

(2)参照Zhang等[16]的试验方法，采用索氏提取法除去油脂。以石油醚作为提取剂，在料液比1∶13、提取温度50℃的条件下提取8 h。提取结束后，将脱脂花椒籽仁置于60℃烘箱中烘干，粉碎至80目备用。

1.2.2 花椒籽仁及花椒籽仁蛋白质基本化学成分的测定

水分测定，参照GB 5009.3—2010；粗脂肪测定，参照GB 5009.6—2010；蛋白质测定，参照GB 5009.5—2010；灰分测定，参照GB 5009.4—2010；碳水化合物测定，参照Zhu等[17]的方法，即碳水化合物的含量按照100%减去样品的水分含量、脂肪含量、蛋白质含量及灰分含量的总和。

1.2.3 花椒籽仁蛋白质提取工艺流程

花椒籽仁脱脂粉→NaCl溶液处理→离心去沉淀→收集上清液→测定蛋白质含量

↓

透析→冷冻干燥→花椒籽仁蛋白质

1.2.4 花椒籽仁可溶性蛋白质含量测定及提取率计算

上清液中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。蛋白质提取率按下式计算：

蛋白质提取率=上清液中蛋白质含量×上清液体积/(花椒籽仁脱脂粉粗蛋白质含量×脱脂粉质量)×100%

2 结果与分析

2.1 花椒籽仁脱脂前后基本化学成分

花椒籽仁脱脂前后基本化学成分见表1。由表1可知，花椒籽仁经过脱脂后蛋白质含量高达 60.91%，这与杨令叶[15]的研究结果近似。

表1 花椒籽仁脱脂前后基本化学成分 %

注：结果为3次测定值的平均值，数据为“均值±标准误差”表示。下同。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取时间对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

在料液比1∶20、NaCl浓度1.0 mol/L、提取温度40℃、提取pH 11的条件下，考察提取时间对花椒籽仁蛋白质提取率的影响，结果见图1。由图1可知，随着提取时间的延长，花椒籽仁蛋白质提取率增大且在提取时间为40 min时达到最大值62.23%；继续延长提取时间，提取率开始不断减小。这可能是因为保证一定的提取时间利于花椒籽仁脱脂粉的充分溶胀从而利于蛋白质的分离溶解；随着提取时间的延长，蛋白质凝聚在一起并出现沉淀[18]。

注：不同字母代表差异极显著(P<0.01)；下同。

2.2.2 料液比对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

在提取时间40 min、NaCl浓度1.0 mol/L、提取温度40℃、提取pH 11的条件下，考察料液比对花椒籽仁蛋白质提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

由图2可知，随着料液比的增大，花椒籽仁蛋白质提取率呈先增大后减小的趋势，在料液比为1∶20时有最大的提取率，这与叶婧等[19]的研究结果一致。

2.2.3 NaCl浓度对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

在提取时间40 min、料液比1∶20、提取温度40℃、提取pH 11的条件下，考察NaCl浓度对花椒籽仁蛋白质提取率的影响，结果见图3。

图3 NaCl浓度对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

由图3可知，随着NaCl浓度的增大，花椒籽仁蛋白质提取率增大，在1.2 mol/L时达到最大值，NaCl浓度继续增大，提取率有所下降。这可能是因为一定浓度的NaCl促进花椒籽仁蛋白质的溶解，但是较高浓度的NaCl则造成了蛋白质盐析作用的发生，提取率降低。

2.2.4 提取温度对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

在提取时间40 min、料液比1∶20、NaCl浓度1.0 mol/L、提取pH 11的条件下，考察提取温度对花椒籽仁蛋白质提取率的影响，结果见图4。

图4 提取温度对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

由图4可知，当提取温度由20℃升高到50℃时，花椒籽仁蛋白质提取率不断增大且增长幅度大；提取温度继续升高到60℃，提取率出现下降。

2.2.5 提取pH对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

在提取时间40 min、料液比1∶20、NaCl浓度1.0 mol/L、提取温度40℃的条件下，考察提取pH对花椒籽仁蛋白质提取率的影响，结果见图5。

图5 提取pH对花椒籽仁蛋白质提取率的影响

由图5可知，提取pH由8增大到11，蛋白质提取率增大；提取pH继续增大，蛋白质提取率减小，由此得出花椒籽仁蛋白质最佳提取pH在11左右。

2.3 响应面法优化试验

2.3.1 响应面试验设计及结果

根据单因素试验结果，固定提取pH为11，选择提取时间(X1)、提取温度(X2)、料液比(X3)、NaCl浓度(X4)为自变量，花椒籽仁蛋白质提取率(Y)为响应值，采用中心组合设计试验。响应面试验因素水平见表2，响应面试验方案及结果见表3。

表2 响应面试验因素水平

表3 响应面试验方案及结果

续表3

试验号X1X2X3X4Y/%1200-2078.8613002082.8114000-278.4315-11-1173.4116-1-11-181.3317111-183.09181-11176.8719020078.62201-11-175.38211-1-1182.912211-1-176.0623-1-11181.9024-111185.4025000276.0626111181.2327-111-187.882811-1173.74290-20084.6530200080.58

2.3.2 回归方程的建立与检验

运用Design-expert 8.0数据统计软件对表3试验结果进行多元回归拟合，得到盐提法提取花椒籽仁蛋白质的数值模型方程为：

对该回归模型的显著性进行方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析

2.3.3 响应面和等高线分析

由表4可以看出，通过F检验查询到因子贡献率为：X1>X2>X3>X4，并且X1X2、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4交互作用对花椒籽仁蛋白质提取率影响显著，响应面和等高线图见图6。

由图6(a)可以看出，当料液比和NaCl浓度固定为零水平时，提取时间和提取温度的交互作用对蛋白质提取率有显著影响。当提取时间固定不变时，随着提取温度的升高蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势；当提取温度固定不变时，随着提取时间的延长蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势。

由图6(b)可以看出，当料液比和提取温度固定为零水平时，提取时间和NaCl浓度的交互作用对蛋白质提取率有显著影响。当提取时间固定不变时，随着NaCl浓度的增加蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势；当NaCl浓度固定不变时，随着提取时间的延长蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势。

由图6(c)可以看出，当提取时间和NaCl浓度固定为零水平时，提取温度和料液比的交互作用对蛋白质提取率有显著影响。当提取温度固定不变时，随着料液比的增加蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势；当料液比固定不变时，随着提取温度的升高蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势。

由图6(d)可以看出，当料液比和提取时间固定为零水平时，提取温度和NaCl浓度的交互作用对蛋白质提取率有显著影响。当NaCl浓度固定不变时，随着提取温度的升高蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势；当提取温度固定不变时，随着NaCl浓度的增加蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势。

由图6(e)可以看出，当提取时间和提取温度固定为零水平时，料液比和NaCl浓度的交互作用对蛋白质提取率有显著影响。当料液比固定不变时，随着NaCl浓度的增加蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势；当NaCl浓度固定不变时，随着料液比的增加蛋白质提取率呈现先增大后减小的趋势。

2.3.4 响应面优化与验证

利用Design-expert 8.0软件对试验结果进行优化，得到盐提法提取花椒籽仁蛋白质的最佳工艺条件为提取时间34.93 min、提取温度50.18℃、料液比1∶20.83、NaCl浓度1.19 mol/L，此时提取率理论值为90.41%。考虑实际可操作性，将提取工艺条件修改为提取时间35 min、提取温度50℃、料液比1∶21、NaCl浓度1.2 mol/L。在此提取条件下进行3次试验验证，测定花椒籽仁蛋白质提取率为88.77%，与预测值吻合度达到98.19%，说明试验值与回归方程预测值吻合良好。

2.4 花椒籽仁蛋白质基本化学成分

花椒籽仁蛋白质基本化学成分见表5。由表5可知，本试验制得花椒籽仁蛋白质含量达到93.17%，明显高于花椒籽仁脱脂粉中蛋白质含量，说明采用此工艺制备花椒籽仁蛋白质是比较合理的。此外，相比于花椒籽仁脱脂粉，花椒籽仁蛋白质的碳水化合物含量显著降低了很多，这会一定程度上影响花椒籽仁蛋白质的某些功能性质。此外，从健康饮食角度来看，低碳水化合物饮食有助于减重和降低心脑血管疾病的发生率[20]，可将其添加到饲料甚至食品中。

表5 花椒籽仁蛋白质基本化学成分 %

3 结 论

通过单因素试验分析，固定提取pH为11，选择提取时间、料液比、NaCl浓度、提取温度作为响应面试验因素进行四因素五水平响应面分析。得出盐提法提取花椒籽仁蛋白质的最佳工艺条件为提取pH 11、提取时间35 min、提取温度50℃、料液比1∶21、NaCl浓度1.2 mol/L，在此提取条件下花椒籽仁蛋白质提取率可达到88.77%，所得蛋白质含量达到93.17%。本试验方法简单，提取时间短，蛋白质提取率高，产品纯度高，可为花椒籽仁蛋白质的进一步利用提供数据参考。

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Optimization of salt extraction of protein fromZanthoxylumbungeanumMaxim. seed kernel by response surface methodology

LI Chao, PU Biao, LIU Xingyan, XU Danping, LUO Songming,WANG Chunxia, JIANG Peiji, PAN Shuxuan, LI Qiang, FU Benning

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014, Sichuan,China)

The salt extraction of protein fromZanthoxylumbungeanumMaxim.seed kernel was investigated, and the effects of extraction time, solid-liquid ratio, NaCl concentration, extraction temperature and extraction pH on the extraction rate of protein were discussed. On the basis of single factor experiment, the extraction conditions of protein fromZanthoxylumbungeanumMaxim.seed kernel were optimized by response surface methodology. The results showed that fixing extraction pH at 11, extraction time had the largest effect on the extraction rate of protein fromZanthoxylumbungeanumMaxim.seed kernel, followed by extraction temperature, solid-liquid ratio and NaCl concentration. The optimal extraction conditions were determined as follows: extraction pH 11, extraction time 35 min, extraction temperature 50℃, solid-liquid ratio 1∶21, and NaCl concentration 1.2 mol/L. Under these conditions, the extraction rate of protein fromZanthoxylumbungeanumMaxim.seed kernel was 88.77%, and the content of the protein reached 93.17%.

ZanthoxylumbungeanumMaxim.seed kernel protein; salt extraction; response surface methodology

2016-10-20;

2017-03-10

国家林业局林业公益性行业科研专项(201304703)；国家林业局行业标准制修订项目(2015-LY-184)

李 超(1991)，男，硕士研究生，研究方向为农产品加工及储藏工程(E-mail)lichao9999@126.com。

蒲 彪，教授，博士生导师(E-mail)pubiao2002@163.com。

TS201.21; TS221

A

1003-7969(2017)06-0097-06