一测多评法同时测定山银花药材中5种皂苷类成分的含量Δ

孙玲，樊晓兰，郭绮，张小蒙，陈磊（.江苏医药职业学院药学院，江苏盐城4005；.四川农业大学动物科技学院，成都630；3.重庆市医疗器械技术审评认证中心，重庆400）

一测多评法同时测定山银花药材中5种皂苷类成分的含量Δ

孙玲1＊，樊晓兰2，郭绮3#，张小蒙1，陈磊1（1.江苏医药职业学院药学院，江苏盐城224005；2.四川农业大学动物科技学院，成都611130；3.重庆市医疗器械技术审评认证中心，重庆401120）

目的：建立同时测定山银花药材中5种皂苷类成分含量的方法。方法：采用高效液相色谱法，以灰毡毛忍冬皂苷乙为内标，计算其对灰毡毛忍冬皂苷甲、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙的相对校正因子（RCF），通过RCF计算上述4种皂苷类成分的含量；以外标法测定的上述皂苷类成分含量作实测值，比较计算值与实测值的差异。结果：灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙检测进样量线性范围分别为0.316～6.32μg（r＝0.997 3）、0.453～9.06μg（r＝0.998 2）、0.231～4.62μg（r＝0.999 6）、0.342～6.84μg（r＝0.998 4）、0.147～2.94μg（r＝0.996 1）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率试验的RSD分别为97.74%～104.51%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.70%～103.20%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.12%～103.61%（RSD＝2.45%，n＝6）、98.80%～104.70%（RSD＝2.32%，n＝6）、99.21%～102.92%（RSD＝1.39%，n＝6）。计算值与实测值差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于山银花药材中5种皂苷类成分含量的同时测定。

一测多评法；山银花；外标法；相对校正因子；灰毡毛忍冬皂苷乙

山银花Lonicerae Flos为忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热的功效[1]，临床上常用于治疗热毒血痢、风热感冒等疾病。山银花药材中有效成分众多，皂苷类成分是除绿原酸外对其药效起关键作用的一类重要成分，其中主要为常春藤皂苷类，即灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲等。

一测多评法的可行性在茶叶、大黄、黄连、人参等药材中得以验证[2-4]，作为一个质量标准测量方法已从2010年版《中国药典》开始被收录。本研究采用一测多评法，根据灰毡毛忍冬皂苷乙与其他成分的相对校正因子（RCF），通过测定灰毡毛忍冬皂苷乙的含量来计算多个皂苷类成分的含量，实现多指标质量分析的目的，并与外标法测定结果进行比较，评价该技术的可行性，为山银花药材中有效成分含量测定的相关研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器

1200型高效液相色谱（HPLC）仪，包括G1311A四元泵、G1313A自动进样器、Alltech 2000ES蒸发光散射检测器、G1316A柱温箱、Agilent Chem Station工作站（美国Agilent公司）；P680型HPLC仪，包括P680A四元梯度泵、SEDEX75蒸发光散射检测器、TCC-100柱温箱、Chromeleon色谱工作站（美国Dionex公司）；AL-204型电子分析天平、AE240型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 试剂

灰毡毛忍冬皂苷甲对照品（上海同田生物技术股份有限公司，批号：140360-201310）；灰毡毛忍冬皂苷乙对照品（批号：136849-201402）、川续断皂苷乙对照品（批号：133289-201405）均购自南京泽朗医药科技有限公司；灰毡毛忍冬次皂苷甲对照品（南京广润生物制品有限公司，批号：128730-201403）；灰毡毛忍冬次皂苷乙对照品（上海诗丹德生物技术有限公司，批号：136849-201403），以上对照品纯度均＞98%；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 药材

山银花药材购自湖南隆回，经笔者鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 基本原理

在一定线性范围内，成分的量（质量或质量浓度）与检测器响应值成正比，f＝W/A（W表示质量浓度，A表示响应值）。在多指标质量评价时，以药材中某一典型组分（有对照品供应者）为内标，建立该组分与其他组分之间的RCF，通过RCF计算其他组分的含量。

假设某样品中含有i个组分，fi＝Wi/Ai（i＝1，2，…，k，…，m），式中Ai为组分响应值，Wi为组分质量浓度。选取其中一组分k为内参物，建立组分k与其他组分m之间的RCF：fkm＝fk/fm＝（Wk×Am）/（Wm×Ak）；由此可导出定量计算公式：Wm＝（Wk×Am）/（fkm×Ak）[5]。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～5m in，15%→18%A；5～8m in，18%→25%A；8～15m in，25%→75%A）；流速：1.0m L/m in；柱温：32℃；进样量：15μL；蒸发光散射检测器（ELSD）漂移管温度：100℃；空气体积流量：3.2 L/m in。在上述色谱条件下，各成分基线分离良好，分离度＞1.5，详见图1。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液精密称取待测成分对照品适量，分别置于25m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙质量浓度分别为0.316、0.453、0.231、0.342、0.147mg/m L的混合对照品溶液。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chrom atogram s

2.3.2 供试品溶液取药材样品，干燥，研磨（过4号筛），精密称取粉末0.5 g，置于圆底烧瓶中，精密加50%甲醇溶液50m L，摇匀，称定质量，加热回流2 h，放冷；再次称定质量，用50%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，置于50m L量瓶中，加50%甲醇溶液定容，摇匀，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.3.1”项下混合对照品溶液1、4、8、12、16、20μL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围，详见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.5 精密度试验

取“2.3.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙峰面积的RSD分别为1.34%、1.73%、0.95%、1.22%、1.93%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.3.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24、48 h时按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙峰面积的RSD分别为1.66%、1.37%、0.89%、1.41%、0.65%（n＝7），表明供试品溶液室温放置48 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一批样品适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙含量的平均值分别为0.072%、4.527%、1.021%、0.053%、0.038%，RSD分别为1.36%、0.72%、1.91%、1.84%、0.73%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量样品适量，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.9 RCF的计算

以灰毡毛忍冬皂苷乙为内标，按“2.1”项下公式计算，结合“2.4”项下系列混合对照品溶液所得峰面积数据，计算灰毡毛忍冬皂苷乙分别对灰毡毛忍冬皂苷甲、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙的RCF，结果见表3。

2.10 一测多评法系统适用性考察

2.10.1 不同HPLC仪和色谱柱考察精密量取“2.3.1”项下混合对照品适量，分别考察不同HPLC仪（Agilent1200、Dionex P680）和不同色谱柱（Agilent XDB-C18、Ultimate XB C18、DiamonsilC18）对RCF的影响。结果，灰毡毛忍冬皂苷乙对灰毡毛忍冬皂苷甲、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分别为1.18%、3.95%、2.89%、3.12%，表明不同HPLC仪和色谱柱对RCF无显著影响。

表3 RCF计算结果Tab 3 Resultsof RCF

2.10.2 不同流速考察精密量取“2.3.1”项下混合对照品适量，分别考察0.8、1.1、1.3m L/m in的流速对RCF的影响。结果，灰毡毛忍冬皂苷乙对灰毡毛忍冬皂苷甲、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分别为2.83%、1.45%、3.61%、2.91%，表明流速对RCF无显著影响。

2.10.3 不同柱温考察精密量取“2.3.1”项下混合对照品适量，分别考察25、30、35、40、45℃的柱温对RCF的影响。结果，灰毡毛忍冬皂苷乙对灰毡毛忍冬皂苷甲、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分别为2.17%、3.21%、2.61%、2.95%，表明柱温对RCF无显著影响。

2.10.4 不同进样量考察分别精密量取“2.3.1”项下混合溶液4、8、10、12、14、16μL，考察不同进样量对RCF的影响。结果，灰毡毛忍冬皂苷乙对灰毡毛忍冬皂苷甲、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分别为3.12%、2.57%、1.36%、2.74%，表明进样量对RCF无显著影响。

2.11 样品含量测定

取药材样品各适量，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按“2.1”项下公式计算样品含量；采用外标法对山银花药材中4种皂苷成分进行多成分同步含量测定，结果见表4（表中ESM为实测值，QAMS为计算值）。结果，两种方法测得结果差异无统计学意义（P＞0.05），表明建立的RCF具有较好的可信度，一测多评法计算结果可靠。

3 讨论

由于中药材的成分较为复杂，很难做到整体质量评价体系的认证，所以对于中药中多组分、多靶点的质量控制成为了近年研究热点。随着人们对中药材中多组分含量控制的深入研究发现，其内部含量在一定程度内察不同HPLC仪、不同色谱柱、不同柱温和不同流速对RCF的影响，结果显示以上因素对RCF无显著影响。最后将计算值与实测值的结果进行了比较，结果表明，差异无统计学意义。因此在缺少对照品的情况下，可以利用RCF对山银花药材的皂苷类成分进行含量测定。

表4 样品含量测定结果（n＝3，%）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：30.

[2]何兵，杨世艳，张燕.一测多评法中待测成分校正和定位的新方法研究[J].药学学报，2012，47（12）：1653-1659.

[3]文乾映，龙芳，杨华，等.中药质量控制中一测多评法的应用进展[J].中国药房，2014，25（23）：2185-2187.

[4]Hou JJ，WuWY，Liang J，etal.A single，multi-faceted，en-hanced strategy to quantify the chromatographically diverse con-stituents in the roots of Euphorbia kansui[J].J Pharm Biomed Anal，2014，88（4）：321-328.

[5]Hou JJ，WuWY，Da J，etal.Ruggedness and robustness of conversion factors inmethod of simultaneous determination ofmulti-componentsw ith single reference standard [J].JChroma TogrA，2011，1218（33）：5618-5627.

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Simultaneous Determ ination of 5 Saponins in Lonicerae Flosby QAMSM ethod

SUN Ling1，FAN Xiaolan2，GUO Qi3，ZHANG Xiaomeng1，CHEN Lei1（1.College of Pharmacy，Jiangsu Vocational College of Medicine，Jiangsu Yancheng 224005，China；2.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Chongqing Accreditation Center for M edical Device and Technology，Chongqing 401120，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determ ination of 5 saponins in Lonicerae Flos.METHODS：Usingmacranthoidin B asa reference，HPLC method wasadopted to calculate the relative correction factor（RCF）of it to macranthoidin A，dipsacoside B，macranthoside A and macranthoside B.The contentsof above 4 saponinswere calculated through RCF.Using the contents of saponins determ ined by external standard method as measured value，the calculated value was compared w ith measured value.RESULTS：The linear ranges ofmacranthoidin A，macranthoidin B，dipsacoside B，macranthoside A and macranthoside B were 0.316-6.32μg（r＝0.997 3），0.453-9.06μg（r＝0.998 2），0.231-4.62μg（r＝0.999 6），0.342-6.84μg（r＝0.998 4）and 0.147-2.94μg（r＝0.996 1），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoverieswere 97.74%-104.51%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.70%-103.20%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.12%-103.61%（RSD＝2.45%，n＝6）、98.80%-104.70%（RSD＝2.32%，n＝6）、99.21%-102.92%（RSD＝1.39%，n＝6），respectively.There was no statistical significance between calculated value and measured value（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Themethod is simple，precise，stable and reproducible.It can be used for the determination of saponins in Lonicerae Flos.

QAMS；Lonicerae Flos；External standard method；Relative correction factor；Macranthoidin B

R927

A

1001-0408（2017）18-2546-04

2016-09-06

2017-03-27）

（编辑：张静）

江苏高校品牌专业建设工程项目（No. PPZY 2015A097）；盐城市医学科技发展计划项目（No.YK2016053）

＊讲师，硕士。研究方向：中药鉴定及中药分析。E-mail：vivianlovesun@163.com

#通信作者：副主任药师。研究方向：临床药学和医疗器械技术审批。E-mail：cqguoqi@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.28