腐植酸紫外—荧光特性及生物农药制备的研究

腐植酸紫外—荧光特性及生物农药制备的研究

方冬冬 王 杰 周霞萍*

(华东理工大学资源与环境工程学院 上海 200237)

泥炭和褐煤是腐植酸的主要来源。通过紫外-荧光光谱分析等可差异性地表征泥炭、褐煤中的黑腐酸、棕腐酸和黄腐酸。腐植酸具有多种生物活性组分，利用工程化的分枝杆菌可定向降解得到某些甾类化合物，利用特异性酵母菌的异源合成可得到萜类和腐植酸萜类组分，通过浓缩、分离、纯化等处理工艺，可以制备具有抗菌，改善植物营养条件的生物农药。

腐植酸 紫外-荧光分析 生物农药

定向降解是一种在催化剂(酶)反应的条件下，利用键能的强弱，将原物质中存在的结构单元或明确的化合物质选择性的反应解析或解离出来。运用分枝杆菌等代谢工程微生物的转化技术，将泥炭、褐煤中的黑腐酸降解转化为棕腐酸组分，同时探索各种甾类化合物转化为结构单一的甾类药物或药物中间体，可便于甾类物质的高效提取，同时实现甾类物质的高值化利用，是很有意义的。

异源合成通过构建目的产物的重组微生物工程菌，利用微生物发酵来生产珍稀萜类等，而且效果呈几何级倍增。腐植酸原产植物的珍稀萜产量极低，直接提取效率低、成本也高。而通过微生物的代谢工程技术，以及微生物对萜类物质的高效特异性富集和转化，实现腐植酸中珍稀萜类化合物的高效提取和高值化利用，是一个极富挑战性的研究领域。萜类化合物作为生物农药的组成部分，具有抑制有害菌群生长、改善自然界碳循环等作用。

裂解-气相色谱-质谱联用技术被应用于研究腐植酸大分子的结构组成特征。但是，直接用气相色谱-质谱联用技术研究腐植酸的组成特征还是比较少的[1]。本文通过气相色谱-质谱联用技术、红外、紫外-可见、分子荧光光谱等表征腐植酸降解产物中某些甾类成分和性质，以及表征酵母菌异源合成的某些腐植酸萜类。并在此基础上[2]，进行腐植酸生物农药的制备研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

泥炭：取自云南中电新能源有限公司；

褐煤：取自云南德坤生物科技有限公司(泥炭、褐煤工业分析和元素分析如表1所示)；

金银花秸秆：取自上海崇明前进农场，作风干处理；

果皮、果渣：为市售巨峰葡萄的残余物；

乙醇、乙酸乙酯、葡萄糖等试剂，均采用华东理工大学采购的分析纯药品；

分枝杆菌(Mycobacterium)：华东理工大学鲁华生物技术研究所提供的工程菌株；

酵母菌(Saccharomyces)：上海立波啤酒厂提供菌种后，由华东理工大学鲁华生物技术研究所改性。

表1 原料分析Tab.1 Analysis of raw materials

1.2 腐植酸的化学表征

根据在不同溶剂中的溶解度，将腐植酸分为黄腐酸、棕腐酸和黑腐酸。实验采用不同溶剂对泥炭、褐煤进行溶解，超声波振荡，过滤，精制。所得样品通过Varian Cary 60型紫外-可见分光光度计，确定激发波长，再用分子荧光光谱仪测定荧光强度，扫描速度为1000 nm/min，扫描光谱仪器自动进行校正。

1.3 由腐植酸得到的甾类、萜类的分析

1.3.1 甾类的分析

实验选用工程化分枝杆菌(Mycobacterium)，菌株培养至OD600为2～3，甘油浓度50%，于-40 ℃冻存。通过种子培养基活化，接种活化后的分枝杆菌于30 mL培养基中，加入灭菌后的黑腐酸，30 ℃，200 r/min摇床培养7天。降解完全后，取500 μL降解产物于洁净离心管中，加入250 μL乙酸乙酯，充分振荡，离心9000 rpm，3 min，萃取液通过Agilent 6890-5973N，HP-5MS色谱柱( 30 m×250 μm×0.25 μm)，气化温度280 ℃，载气流速 0.7 mL/min，进样量1 μL，质谱电子能量70 eV，扫描质量范围(m/z)33～500。

1.3.2 萜类的分析

酵母菌(Saccharomyces)作为真菌，具有成熟的真核表达系统，其甲羟戊酸途径为异源萜类化合物的合成提供了前体。通过甲羟戊酸途径，酵母菌可以高效合成萜类化合物[3，4]。利用秸秆和果皮作为泥炭、褐煤的辅助发酵原料，通过育菌和驯化等改性生物工程，在特定条件下实现酵母菌异源合成萜类，确定腐植酸萜类的主要成分，并比较其对胶孢炭疽菌的抑制作用。

2 结果与讨论

2.1 腐植酸的荧光性质表征

腐植酸分子中含有大量的苯环、稠苯环和杂环，环之间以桥键连接，环及支链上有羧基、酚羟基、醌基、甲氧基等各种官能团，具有较特殊的荧光性质。

图1是先根据紫外-可见吸收光谱确定了泥炭黑腐酸的最大激发波长是273 nm，褐煤黑腐酸的最大激发波长是274 nm，而后进行荧光光谱分析。从图1可以看出，泥炭黑腐酸荧光光谱峰有较好的对称性。随着浓度的增加，黑腐酸的荧光强度增加，溶液中的荧光基团含量也增多，浓度达到一定程度时，黑腐酸分子聚集，导致荧光自猝灭[5]。激发波长也会随浓度的增大而增大，出现轻微的红移[6]。

图1 不同浓度泥炭黑腐酸的荧光光谱图Fig.1 Fluorescence spectra of different concentrations of humic acids from peat

实验选用0.01%泥炭或褐煤与溶剂混合。除了浓度的影响外，温度和pH值对黑腐酸的荧光强度也有一定的影响。当温度升高时，分子运动速度加快，分子间碰撞概率增加，使无辐射跃迁增加，黑腐酸的荧光强度降低[7]。而在不同pH显示的酸性溶液中，因分子和离子间的平衡改变，使荧光强度也有差异。

图2中黑腐酸的荧光发射光谱峰值出现在450～480 nm之间，这是由于黑腐酸具有多种荧光发色基团[8]。图中545 nm处为瑞利散射的倍频峰。

从图2可以看出，泥炭和褐煤棕腐酸在360 nm左右有荧光峰，而黄腐酸没有。棕腐酸其余的荧光峰与黄腐酸相似，可能是因为黄腐酸也一部分溶于醇，致使棕腐酸精制样品中含有一部分黄腐酸。从图2还可以看出，泥炭和褐煤的黄腐酸荧光光谱也有极高的相似性。黄腐酸的发光谱峰相对棕腐酸稍有红移，这是由于极性分子电子云对荧光分子的影响，π→π*跃迁需要的能量差ΔE减小，跃迁概率增加，使荧光光谱发生红移，甚至猝灭。

图2 泥炭、褐煤棕腐酸和黄腐酸的荧光图Fig.2 Fluorescence spectra of humic acids, hymatomelanic acids and fulvic acids

2.2 腐植酸甾类农药的分析及制备

泥炭腐植酸具有多种生物活性成分，通过工程化分枝杆菌的定向降解，得到的结果如图3所示。

图3 分枝杆菌降解前后的泥炭腐植酸GC/MS分析Fig.3 GC/MS analysis of samples before and after the microbial degradation

图3显示的是泥炭腐植酸降解前后的色谱总离子流图。在降解产物中共检测出20多种物质，包括烷烃、有机酸、酮、醇、酯、萜类和甾类化合物。根据峰面积归一化法测定各成分的相对百分含量。相比腐植酸降解前，定向降解后的萃取液中检出多种新物质，其出峰时间在25 min左右，分子量在239～446，这些小分子物质是腐植酸的大分子物质经分枝杆菌降解生成的。

烷基取代苯酚是腐植酸中常见的化合物，一般认为苯酚类物质可能来源于蛋白质、聚羧酸、碳水化合物或木质素等。降解前，出峰时间为15.62 min的物质为2，4-二叔丁基苯酚，相对含量为1.15%，降解后，其相对含量为2.46%，可解释为腐植酸在分枝杆菌定向降解过程中，部分黑腐酸组分降解为棕腐酸级分，包括2，4-二叔丁基苯酚成分。张新慧等考察2，4-二叔丁基苯酚对植物根际微生物生长的影响，发现低浓度的2，4-二叔丁基苯酚能促进土壤微生物数量的显著增加[9]。

降解产物中检出一些含氮物质，可表明氨基酸、蛋白质和多糖等物质参与了泥炭腐植酸的形成。这些含氮物质可以为植物提供营养，促进植物生长。在出峰时间21.66 min处，检出有泪杉醇，相对含量为2.27%，这是一种双环二萜类化合物，可干扰细菌代谢，达到抗菌效果。同时检出类似豆甾醇结构的物质，出峰时间为24.49 min，在农业生产中，豆甾醇可以作为农业除草剂和杀虫剂的原料，抑制黄瓜炭疽病、小麦赤霉病、玉米大斑病孢子萌发，同时还能较好地抑制番茄灰霉病菌丝的生长[10]。

麦角甾类也从降解产物中检出，作为农药，其抑制剂活性高、不易产生抗药性。烯唑醇和咪鲜胺等麦角甾醇脱甲基抑制剂对葡萄胶孢炭疽菌具有敏感性，供试菌株对咪鲜胺的EC50值在0.01～1.58 mg/L之间，高于其对烯唑醇(EC50 0.05～25.45 mg/L)的敏感性。田间试验表明科学合理地应用麦角甾醇脱甲基抑制剂防治葡萄炭疽病，可延缓或避免菌株抗药性的产生，减小对潜在抗性菌株的选择性压力[11]。

分枝杆菌定向降解泥炭腐植酸得到的甾类，经浓缩、分离、纯化等过程可以得到甾类原药。向甾类原药中加入惰性填料和一定量的分散剂，按比例经充分混合粉碎后，达到一定粉粒细度。这些粉状农药可以直接施于植物根部，被根系吸收，也可加水湿润、分散，喷洒施用。粉状甾类农药具有储运方便、安全的特点，包装材料容易处理，对植物也较安全。

2.3 腐植酸萜类农药的分析及制备

利用改性后的酵母菌对褐煤的异源合成，在添加秸秆、果皮等辅料的条件下进行。试验得到的萜类化合物(结构式见图4)可通过核磁共振波谱法(NMR)、高级液相色谱-质谱(HPLC-MS)和红外光谱(IR)确认(图5)。

图4 腐植酸萜类化合物结构式Fig.4 Structure diagrams of terpenoids in humic acids

图5 利用IR标谱检索到的腐植酸中的萜类及C-27甾类物Fig.5 Terpenoids and C-27 steroid of humic acid retrieved using IR

萜类、腐植酸萜类组分对胶孢炭疽菌的初步抑制试验，是在温度30 ℃，抑制时间8 h，以活菌对照106cfu/mL的条件下得到的。不同浓度萜类对胶孢炭疽菌的抑制率见表2。可以看出，随着萜类浓度的升高，其对胶孢炭疽菌的抑制率先升高后下降，其中以0.005 μg/mL的萜类对胶孢炭疽菌的抑制效果最好，抑制率为95.7%。

表2 不同浓度萜类对胶孢炭疽菌的抑制率Tab.2 Inhibition rates of different concentrations of terpenoids in humic acids upon colletotrichum gloeosporioides

萜类、腐植酸萜类组分的亲脂性强，可透过细胞膜，进入到细胞内，影响细胞膜的结构和功能，干扰病原微生物的正常生理代谢，对病原微生物起到防御作用。研究表明，腐植酸含氧单萜类物质对稗草有抑制作用。不同萜类物质处在不同浓度时，“抑草”的效果存在差异性。几种萜类物质组合后对稗草的最高抑制率为93.96%[12]。

酵母菌异源合成得到的萜类、腐植酸萜类组分，经浓缩、分离、纯化等可得到萜类原药[13]。向原药中加入非离子表面活性剂，如吐温、脂肪胺、甘油脂肪酸酯类，以水为介质，超微粉碎制成粘稠状可流动的悬浮液，喷洒于作物表面，可吸附于微粒表面形成不同的分散体系，改善植物叶片上生物农药的分布和渗透，提高利用率。

3 结论

(1) 紫外-荧光光谱分析等可差异性地表征泥炭、褐煤中的黑腐酸、棕腐酸和黄腐酸。

(2) 分枝杆菌(Mycobacterium)定向降解泥炭腐植酸得到了20多种组分，其中的甾类化合物包括豆甾醇衍生物以及麦角甾醇等。

(3) 通过改性酵母菌(Saccharomyces)的异源合成实验，得到的萜类和褐煤腐植酸萜类组分，对胶孢炭疽菌的抑制率可达95.70%。

(4) 初步研究了分支杆菌和改性酵母菌降解腐植酸生成甾类原药和萜类原药，为腐植酸制备生物农药和腐植酸在农药上的应用提供了实验数据理论基础。

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UV-f l uorescence Characteristics and Biological Pesticide Research on Humic Acid

Fang Dongdong, Wang Jie, Zhou Xiaping*
(College of Resource and Environmental Engineering, East China University of Science andTechnology, Shanghai,200237)

Humic acids are mainly derived from peat and lignite. The difference of surface characteristics of black humic acid, brown humic acid and fulvic acid in peat and lignite was analysed by the UV-f l uorescence spectrum. Humic acids have many biological active ingredients. Steroid compounds could be obtained by engineered mycobacteria directional degradation, and humic acid terpenoids could be obtained through heterologous biosynthesis by specif i c saccharomycetes. The fermented products were antimicrobial, and can improve the conditions of plant nutrition. Through the enrichment, separation and purif i cation processes, they could be used as biological pesticide.

humic acids; UV-f l uorescence analysis; biological pesticide

TQ314.1，F767.2

1671-9212(2017)03-0044-06

A

10.19451/j.cnki.issn1671-9212.2017.03.005

2015-10-23

方冬冬，女，1992年生，硕士研究生，主要研究方向为腐植酸物理化学性质及生物农药的制备。*通讯作者：周霞萍，女，教授，E-mail：ecust_zxp@163.com。