α-硫辛酸对帕金森病大鼠脑内黑质多巴胺能神经元保护机制研究

吴艳芬 陈文 王鸣飞 王伟

·论著·

α-硫辛酸对帕金森病大鼠脑内黑质多巴胺能神经元保护机制研究

吴艳芬 陈文 王鸣飞 王伟

目的 探讨α-硫辛酸(LA)对帕金森病(PD)大鼠模型脑内黑质多巴胺能神经元的保护机制。方法 60只3月龄雄性Wistar大鼠随机分为对照组、实验组和药物干预组，每组20只。对照组大鼠给予背部皮下注射葵花油，实验组和药物干预组背部皮下注射鱼藤酮制备PD模型，药物干预组大鼠同时给予LA腹腔注射；采用Western blot检测大鼠中脑多巴胺能神经元中酪氨酸羟化酶(TH)、转录因子NF-E2相关因子-抗氧化反应元件(Nrf2-ARE)和血红素氧合酶1(HO-1)的表达变化；采用分光光度法检测大鼠脑内纹状体中丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量变化。结果 实验组大鼠中脑TH蛋白表达比对照组明显降低(P<0.05)；药物干预组中脑TH蛋白在黑质比鱼藤酮组明显增高(P<0.05),但是较对照组仍有明显减少(P<0.05)。实验组大鼠Nrf2和HO-1蛋白表达比对照组明显降低(P<0.05)；药物干预组Nrf2和HO-1蛋白表达比实验组明显增高(P<0.05)，但是较对照组仍有明显降低(P<0.05)。与对照组相比，实验组大鼠纹状体组织中脂质代谢产物MDA含量明显增加(P<0.01)，药物干预后纹状体中MDA含量明显减少(P<0.05)，但较对照组仍明显增高(P<0.05)。与对照组相比，实验组大鼠GSH的含量明显减少(P<0.01)，药物干预后GSH明显增加(P<0.05)，但较对照组仍显著降低(P<0.05)。结论 LA能激活Nrf2-ARE信号通路对PD大鼠模型中脑多巴胺能神经元起到有效的神经保护作用，改善PD样症状。

帕金森病；α-硫辛酸；氧化应激；转录因子NF-E2相关因子-抗氧化反应元件；血红素氧合酶1

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一种中老年人常见的神经退行性疾病，其主要病理改变为中脑黑质多巴胺能神经元的胞体内嗜酸性包涵体形成及其变性坏死，从而导致脑内多巴胺能神经递质含量减少，临床表现为静止性震颤、运动迟缓和肌张力增高等症状[1]。目前PD确切的病因和发病机制尚不明确，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD患者脑内多巴胺能神经元的变性死亡过程。PD在临床的治疗中还没有特效药物，多为外源性补充多巴胺能药物延缓病情恶化，但由于长期用药导致自身对多巴胺制剂敏感性降低、毒副作用不能耐受等原因，使患者不得不减少药物服用剂量或终止治疗[2-4]。因此，寻找能够有效保护PD患者脑内多巴胺能神经元的药物，提高药物治疗的安全性是当前亟待解决的科学难题。氧化应激是指体内的抗氧化能力减弱，导致体内的自由基过度蓄积，从而对机体产生一系列的负面作用，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。氧化应激可在多个环节参与脑内黑质多巴胺能神经元的损伤。因此，阻止氧化损伤及其诱导的一系列级联反应很可能成为治疗PD极具前景的有效方法[5]。转录因子NF-E2相关因子(transcription factor NF-E2-related factor，Nrf2)通过与抗氧化反应元件(antioxident response element，ARE)结合诱导多种内源性多种抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶表达上调，是细胞氧化应激反应中的关键因子，具有提高机体的抗氧化和解毒能力。其中，Nrf2-ARE 信号通路诱导的内源性保护基因血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)在抗氧化损伤方面起着重要作用[6,7]。Nrf2-ARE信号通路是机体内最为重要的内源性抗氧化损伤通路之一。α-硫辛酸(LA)又名1,2-二硫戊环-3-戊酸，是1937年在马铃薯中发现的一种B 族维生素，由于其具有强大的抗氧化能力，被誉为“万能抗氧剂”[8]。本研究探讨LA对PD大鼠模型脑内多巴胺能神经元保护作用及其机制，为帕金森病的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 12周龄雄性Witstar 大鼠60只，体重(300±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供(合格证号：SCXK冀2008-1-003)。将实验大鼠随机分为对照组、实验组和药物干预组，每组20只。所有大鼠在同一实验室按照清洁级标准饲养，期间所有大鼠自由进食进水，房间保持稳定的温度(24℃)和湿度(40%)。

1.2 动物模型的制备及药物干预 对照组大鼠给予背部皮下注射葵花油1 ml·kg-1·d-1，实验组和药物干预组大鼠按照2.0 mg·kg-1·d-1背部皮下注射鱼藤酮(鱼藤酮溶解在葵花籽油中充分震荡混匀)，药物干预组大鼠在鱼藤酮注射前半小时给予LA 20 mg·kg-1·d-1腹腔注射，共30 d。

1.3 实验动物的取材及组织匀浆制备 每组各取8只大鼠断头处死，在冰板上分离中脑和纹状体液氮速冻后，-80℃保存备用。匀浆制备时，取纹状体和中脑称重，放入匀浆器，按1∶9(组织重量与裂解液体积比)比例加入RIPA裂解液，匀浆器放在冰浴中，超声匀浆器以2 000 r/min匀浆20次，然后吸至1 ml离心管中。4℃放置30 min。低温离心10 000 g，30 min。小心吸出上清分装，-80℃储存备用。

1.4 蛋白浓度的测定(BCA 法) 蛋白浓度的测定按照BCA蛋白测定试剂盒说明书上的步骤，取一酶标板，各孔加入 200 μl BCA 工作液，取稀释样品 10 μl加入各孔中，在振荡器上将各酶版孔中的液体混匀，将酶标仪开机问题调至37℃，将酶标版放入30 min，然后562 nm下比色测定。并根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查到相应蛋白含量(μg)/样品稀释液总体积(10 μl)×样品稀释倍数即为样品实际浓度(μg/μl)。

1.5 Western blot 取各组实验大鼠脑组织匀浆样品50 μg总蛋白常规变性后自然冷却，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，电泳转移至NC膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入抗体稀释液稀释的兔TH单克隆抗体(1∶5 000，Sigma)、兔Nrf2和HO-1单克隆抗体(1∶1 000，Abcom)，4℃过夜。NC膜以TTBS洗3次。羊抗兔IgG 荧光抗体(1∶2 000，Rocland 公司)室温避光1 h，TTBS漂洗5 次，远红外荧光扫描成像系统扫描并测定目标蛋白光密度值，所得值与Actin (1∶5 000，Santa Cruz)蛋白的光密度值比值后，做统计学分析。

1.6 分光光度法检测脑组织丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量测定 取大鼠纹状体脑组织，在4℃RIPA裂解液匀浆， 低温离心10 000 g 30 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。具体检测MDA和GSH的实验方法按所购试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 一般状况 与对照组相比，实验组大鼠毛色变黄变脏，体态呈弓背屈曲状、主动活动减少、动作迟缓、行走时多向一侧旋转。实验组大鼠在第10、13、15、19天时各死亡1只，药物干预组大鼠腹腔注射LA后上述症状有明显改善，在另第13、14天时各死亡1只。

2.2 Western blot实验结果

2.2.1 TH在大鼠中脑黑质多巴胺能神经元中的表达改变：实验组大鼠中脑TH蛋白表达比对照组明显降低(P<0.05)；药物干预组中脑TH蛋白在黑质比鱼藤酮组明显增高(P<0.05),但是较对照组仍有明显减少(P<0.05)。见图1，表1。

图1 TH蛋白在各组大鼠中脑黑质中的表达

组别TH/ActinNrf2/ActinHO-1/Actin对照组 0.87±0.040.74±0.050.91±0.05实验组 0.35±0.06*0.41±0.05*0.23±0.04*药物干预组0.63±0.03*#0.55±0.05*#0.45±0.03*#

注：与对照组比较，*P<0.05;与实验组比较,#P<0.05

2.2.2 Nrf2和HO-1在大鼠中脑黑质多巴胺能神经元中的表达改变：实验组大鼠Nrf2和HO-1蛋白表达比对照组明显降低(P<0.05)；药物干预组Nrf2和HO-1蛋白表达比实验组明显增高(P<0.05)，但是较对照组仍有明显降低(P<0.05)。见图2，表1。

图2 Nrf2和HO-1蛋白在3组大鼠中脑黑质中的表达

2.3 大鼠纹状体中氧化应激参数的改变 与对照组相比，实验组大鼠纹状体组织中脂质代谢产物MDA含量明显增加(P<0.01)，药物干预后纹状体中MDA含量明显减少(P<0.05)，但较对照组仍明显增高(P<0.05)。与对照组相比，实验组大鼠GSH的含量明显减少(P<0.01)，药物干预后GSH明显增加(P<0.05)，但较对照组仍显著降低(P<0.05)。见表2。

组别MDA(nmol/mgprot)GSH(mg/gprot)对照组 6.21±1.5558.73±4.58实验组 22.13±2.04*31.40±2.61*药物干预组13.25±2.21*#42.46±2.11*#

注：与对照组比较，*P<0.05;与实验组比较,#P<0.05

3 讨论

PD的特征性病理改变是黑质内多巴胺能神经元受损，导致脑内多巴胺能神经递质含量减少，从而临床表现为运动障碍为主的临床综合征。PD发病后病情进展迅速，到疾病晚期患者的生活不能自理，完全需要家人护理和照顾，给家庭和社会带来了沉重的经济负担。随着中国人口老龄化的到来，PD的发病率也逐年增加，目前还没有特效药物能治疗该病，临床上的药物多为暂时缓解患者的症状，但是不能有效逆转中脑黑质多巴胺能神经元的损伤，随着患者病情加重，药物还会引起患者出现异动症和症状波动等不良反应，随着治疗时间的延长，患者对药物的疗效会越来越差[10]。所以，寻找PD的病因和治疗药物是摆在广大科研工作者面前的重大难题。

关于PD的病因和发病机制在神经科学界近年开展了大量的科学研究。研究发现，PD的主要病因为家族遗传因素和外界环境毒素的接触，其中环境因素在PD发病过程中的作用越来越受到医学科研工作者的重视[11]。鱼藤酮为脂溶性，可透过血脑屏障进入中枢神经系统，其进入神经系统后可以神经元内的线粒体电子传递脱氢酶结合并使其失去活性，导致神经元对氧的利用障碍和能量产生不足，最终导致神经元的凋亡和坏死。近年研究发现，中脑黑质多巴胺能神经元对鱼藤酮的毒性较敏感，鱼藤酮进入中枢神经系统后可以特异性的对多巴胺能神经元产生神经毒性[12]。实验大鼠长期慢性接触鱼藤酮后可以出现类PD样症状，表现为活动减少、行走时向一侧旋转等症状，病理研究后发现大鼠脑内出现多巴胺能神经元减少，同时在神经元出现了PD特征性病理变化嗜酸性包涵小体以及脑内纹状体酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达显著降低。我们通过给予大鼠背部皮下注射鱼藤酮后发现，该药物可以导致大鼠出现运动减少和行走时向一侧旋转等类帕金森样症状，表明鱼藤酮是制备PD动物模型有效药物，这与以往的研究结果一致。目前用于制备PD动物模型的两种毒性物质六羟多巴(6-OHDA)和MPTP 均需多巴胺转运体将其摄取，选择性地损伤脑内的多巴胺能神经元，从而导致实验动物出现类PD样症状。但实验动物多巴胺能神经元内始终没有嗜酸性包涵体的出现。然而，长期慢性给予实验动物鱼藤酮可以损伤其脑内的黑质多巴胺能神经元，同时在神经元内可有嗜酸性包涵小体形成，该动物模型对左旋多巴药物治疗较为敏感[13]。以上的实验证据表明，鱼藤酮所致的PD模型更接近自然发生的疾病状态；为PD的发病机制和治疗药物的筛选提供了较为适宜的动物模型。

氧化应激是指机体抗氧化能力减弱，产生大量氧自由基和氮自由基，过量的自由基可以对DNA和脂质等产生不可逆性损伤，从而导致机体疾病发生。科学研究发现，氧化应激被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。因此抗氧化损伤，减少脑内氧自由基的蓄积应是延缓疾病进展的一条重要途径[14]。

谷胱甘肽(GSH)是一种肽类化合物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸共价键结合而成，它是对机体保护的主要肽类物质之一，能有效地和体内的过氧化物及某些重金属离子结合而降低其毒性，经过机体的代谢将其排出体外，维持体内的还原状态，是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂[15]。因此机体内GSH含量是衡量抗氧化能力的重要指标。本实验中，鱼藤酮背部皮下注射的大鼠脑内纹状体中GSH 含量显著低于对照组，我们的结果表明，PD大鼠脑内出现了氧化应激状态，产生了大量的氧自由基，而自身的抗氧化能力下降，导致氧自由基堆积，造成神经元的损伤。MDA 是机体内脂质发生过氧化反应的终产物，具有较强的细胞毒性，能引起机体蛋白质、DNA等交联聚合，对机体产生不可逆性损伤。由于MDA 为氧化代谢产物，其再体内的含量可以直接反映体内脂质过氧化程度和引起脂质过氧化的自由基的水平[16]。本实验中，鱼藤酮背部皮下注射的实验组大鼠脑内MDA 含量明显升高，提示在PD大鼠脑内发生了氧化应激反应，使脂质过氧化过程增强。既往也有研究报道，PD患者脑内发生了氧化应激反应，可以损伤脑内的多巴胺能神经元[17]，这与我们的研究结果一致。

LA是一种硫醇类化合物，众多研究结果提示，LA具有强大的亲电性和较强的清除活性氧的能力，抑制其对脂质、蛋白质和DNA 等生物大分子的损伤，抑制细胞氧化应激，是机体理想的抗氧化剂。同时，LA可保护机体免受各种有害因素的侵袭，包括解毒、抗炎及清除过量重金属离子等。基于以上生物学特性，LA已广泛应用与临床疾病的辅助治疗，包括心血管疾病、认知障碍性疾病、糖尿病等与氧化应激和炎症相关性疾病[18]。

Nrf2 是机体内的一种重要的核转录因子，其本身的结构为亮氨酸拉链，机体的正常情况下，Nrf2 的氨基端和Keap1 蛋白特异地结合，使Nrf2 的活性受到抑制，从而稳定地存在细胞的胞浆内。当机体发生氧化应激反应，产生过度的氧自由基可以作为诱导剂有效的导致Nrf2 磷酸化后与Keap1解离，解离后的Nrf2能够进入细胞核与抗氧化反应元件(ARE)结合，从而诱导机体内源性抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶表达上调，提高细胞的抗氧化和解毒能力，具有显著细胞保护作用[19]。HO-1和NQO1为Nrf2-ARE结合后诱导产生的重要的抗氧化酶。研究证实，在脑血管病、癫痫、痴呆和糖尿病周围神经病变等神经系统疾病中上调Nrf2、HO-1或者NQO1的表达能起到神经保护作用[20]。我们的前期研究发现，PD大鼠模型脑组织中Nrf2、HO-1和NQO1的表达明显降低[21]，其受损程度和黑质多巴胺能神经元的表达呈正相关。本实验研究发现，给予PD大鼠模型腹腔注射LA后能激活Nrf2-ARE通路，诱导其下游产物表达增强，改善脑内的氧化应激状态，从而对黑质多巴胺能神经元起到保护作用。

本研究发现，给予PD大鼠模型LA腹腔注射能有效激活Nrf2-ARE通路，使Nrf2进入细胞核诱导其下游产物HO-1和NQO1表达增强，改善脑内的氧化应激状态，可以对黑质多巴胺能神经元起到保护作用，从而改善PD大鼠模型的运动障碍症状。我们的研究证实氧化应激损伤在PD患者的发病过程中指着重要的病理作用，抗氧化剂LA能有效地保护帕金森模型脑内的多巴胺能神经元，为PD的临床治疗提供了新的靶点，同时为临床药物的选择提供了新的思路。

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Protecive effects of alpha-lipoic acid on brain substantia nigra dopaminergic neurons in rats with Parkinson’s disease and its action mechanism

WUYanfen*,CHENWen*,WANGMingfei,etal.

*DepartmentofEndocrinology,TheFirstHospitalofHandanCity,Hebei,Handan056001,China

Objective To investigate the protecive effects of alpha-lipoic acid (LA) on brain substantia nigra dopaminergic neurons in rats with Parkinson's disease (PD) induced by rotenone, and to explore its action mechanism.Methods Sixty healthy male Wistar rats (3-month age) were randomly divided into three groups:control group, experimental group and drug intervention group,with 20 rats in each group. The rats in control group were given sunflower oil by subcutaneous injection, however,the rats in experimental group and drug intervention group were given rotenone by subcutaneous injection to establish PD models,moreover,the rats in drug intervention group were given LA simultaneously by peritoneal injection.The expression levels of tyrosine hydroxylase (TH), transcription factor NF-E2 related factors, anti-oxidant response elements (Nrf2-ARE) and heme oxygenase 1 (HO-1) in brain substantia nigra of rats were detected by Western Blot,moreover, the levels of malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) in brain striatum of rats were detected by spectrophotometric method.Results The expression levels of TH protein in mesencephalon of rats in experimental group were significantly lower than those in control group (P<0.05),however, the expression levels of TH protein in brain substantia nigra of rats in drug intervention group were significantly higher than those in experimental group (P<0.05), but which in drug intervention group were significantly lower than those in control group (P<0.05). The expression levels of Nrf2 and HO-1 protein in experimental group were significantly lower than those in control group (P<0.05),however, which in drug intervention group were significantly higher than those in experimental group (P<0.05),moreover,which in drug intervention group were significantly lower than those in control group (P<0.05). As compared with those in control group, the levels of MDA in striatum tissues of rats in experimental group were significantly increased (P<0.05),however, after drug intervention,the levels of MDA were significantly decreased (P<0.05),but which were still significantly higher than those in control group (P<0.05). As compared with those in control group, the levels of GSH in experimental group were significantly decreased (P<0.01), however, after drug intervention,the levels of GSH were significantly increased (P<0.05), but which were still significantly lower than those in control group (P<0.05).Conclusion LA can effectively activate the Nrf2-ARE signal pathway to relieve the injury of dopaminergic neurons in brain of rats,moreover,which can improve the symptoms of PD.

Parkinson’s disease; α-lipoic acid; oxidative stress; transcription factor NF-E2-related factor /antioxident response element; heme oxygenase-1

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.006

项目来源：河北省邯郸市科学技术研究与发展计划项目(编号：1423108128)

056001 河北省邯郸市第一医院内分泌科(吴艳芬、陈文),神经内科(王伟)；河北省邯郸市妇幼保健院(王鸣飞)

王伟，056001 河北省邯郸市第一医院神经内科;

E-mail：sunnywangwei@163.com

R 742.502

A

1002-7386(2017)14-2105-05

2017-01-26)