香菇多糖对肝癌细胞Huh7.5.1增殖的影响*

李永格

(南阳医学高等专科学校基础医学部， 河南 南阳473000)

·实验研究·

香菇多糖对肝癌细胞Huh7.5.1增殖的影响*

李永格

(南阳医学高等专科学校基础医学部， 河南 南阳473000)

目的：探讨香菇多糖对肝癌细胞Huh7.5.1增殖的影响及其机制。方法：采用MTT法检测6.25，12.5，25，50，100 mg/L香菇多糖分别作用肝癌细胞24，48，72 h后，肝癌细胞增殖抑制率变化；qRT-PCR检测100 mg/L香菇多糖处理肝癌细胞48 h后，微小RNA138(miR-138)表达变化。结果：细胞的增殖抑制率随香菇多糖质量分数的增高、作用时间的延长呈依赖性升高；相同作用时间，12.5，25，50，100 mg/L香菇多糖组的细胞增殖抑制率较6.25 mg/L组明显升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；相同质量分数的香菇多糖组48 h、72 h的细胞增殖抑制率较同组内24 h明显升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；100 mg/L香菇多糖作用48 h后肝癌细胞抑制率为(50.36±5.13)%，作为后续实验质量分数和作用时间。qRT-PCR检测发现，100 mg/L香菇多糖处理肝癌细胞48 h后，miR-138表达明显高于对照组，差别有统计学意义(P<0.05)。结论：香菇多糖能够抑制肝癌细胞增殖，可能是通过提高肝癌细胞miR-138表达实现的。

香菇多糖/药效学；肝癌；微小RNA138；细胞增殖抑制率

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，在我国每年新发生的肝癌病例约占总数的一半，病死率在恶性肿瘤中居第二位[1]。肝癌起病隐匿，确诊时已到达疾病晚期或已经发生转移，治疗困难。中药在防治肝癌复发、转移，改善中晚期患者症状，延长生存期方面具有明显优势。香菇多糖(lentinan，LNT)为香菇子实体细胞壁的结构成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗病毒等多种生物活性[2-3]。LNT已在肝癌治疗中发挥作用，但作用机制尚不清楚。本研究通过LNT体外作用于Huh7.5.1肝癌细胞，观察肝癌细胞增殖变化，qRT-PCR检测miR-138表达，从微小RNA(microRNAS，miRNAs)角度探讨LNT对肝癌作用机制，为LNT抗肝癌的作用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肝癌细胞系Huh7.5.1购自上海中科院细胞库，本课题组保存。

1.2 药品、试剂及仪器

香菇多糖为南阳医学高等专科学校国家中药分析实验室惠赠，批号1541023。四甲基偶氮唑盐(MTT)，购自美国Sigma公司，批号1602013；100 mL/L 胎牛血清(1600123)、DMEM培养基(1600123)，均为美国Invitrogen公司产品；RIPA裂解液，南京生兴生物技术有限公司产品，批号1605032；Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR quantitation Kit(批号1603215)、U6 snRNA Real time RT-PCR nomallization Kit(批号1603215)，均为上海吉玛制药技术有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯或化学纯。680酶联检测分析仪，美国伯乐公司产品；ABI7500荧光定量PCR仪，ABI公司产品。

1.3 细胞培养

将人肝癌细胞系Huh7.5.1培养在100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中常规培养。取生长良好并处于对数生长期的细胞用于实验。

1.4 检测指标

1.4.1 MTT法检测LNT对细胞增殖抑制率的影响

取处于对数生长期的肝癌细胞接种于96孔板中(2×103个/孔)，细胞贴壁后，弃去培养液，分别用预先制备好的含不同质量分数(100，50，25，12.5，6.25 mg/L)LNT的安全培养液200 μL孵育，设为LNT组，每个质量分数设5个复孔。对照组加不含LNT的DMEM培养液200 μL。分别孵育24，48和72 h后，每孔加20 μL的MTT，继续培养4 h后，小心吸去上清后，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)溶液，水平振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪中，以波长为490 nm测定每孔光密度(D值)。重复测定4次，计算细胞生长抑制率。抑制率(%)=(1-DLNT组/D对照组)×100%

1.4.2 qRT-PCR检测细胞miR-138表达量

根据1.4.1结果选取质量分数为100 mg/L LNT处理48 h肝癌细胞和对照组细胞，进行qRT-PCR实验。Trizol法提取肝癌细胞总RNA，参照试剂盒说明书合成cDNA，其具体反应体系为20 μL：2 μL总RNA，1.25 μL特异性茎环引物，0.5 μL逆转录酶(MMLV)，0.5 μL RNA酶抑制剂，1 μL dNTP以及4 μL逆转录缓冲液，补DEPC水配成20 μL反应体系。充分混匀后按17 ℃ 30 min，45 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min体系进行逆转录，逆转录结束后立即将cDNA产物快速置冰上冷却。以cDNA为模板，利用miR-138特异性引物和染料分子SYBR Green进行PCR扩增。其反应体系如下(20 μL)：2 μL cDNA模版，10 μL SYBR Green反应缓冲液，1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)，6 μL ddH2O。反应条件如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。以U6作为内参，所有检测结果均采用2-ΔCt的方法进行分析。反应中所使用引物序列设计如表1。

表1 miR-138以及内参U6引物序列

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 不同质量分数LNT对Huh7.5.1细胞增殖的影响

LNT对Huh7.5.1细胞增殖有明显抑制作用，且表现为量效、时间依赖性：在同一时间点，药物质量分数越高，细胞增殖抑制率越高；同一质量分数药物作用，时间越长，细胞增殖抑制率越高。相同作用时间，12.5，25，50，100 mg/L香菇多糖组的细胞增殖抑制率较6.25 mg/L组明显升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；相同质量分数的香菇多糖组48 h、72 h的细胞增殖抑制率较同组内24 h明显升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；且100 mg/L LNT作用48 h后，细胞生长出现半抑制，故选择100 mg/L LNT作用48 h来进行后续研究。见表2。

组 别细胞增殖抑制率24h48h72h香菇多糖6.25mg·L-1组10.51±2.5620.36±2.12#27.36±2.31##香菇多糖12.5mg·L-1组14.53±3.62*26.12±2.13*#36.21±4.32*##香菇多糖25mg·L-1组19.52±4.36**32.13±4.32**#46.35±5.23**##香菇多糖50mg·L-1组26.03±3.02**40.12±5.01**#57.18±6.28**##香菇多糖100mg·L-1组35.08±5.01**50.36±5.13**#70.13±6.96**##

注:与同一时间点香菇多糖6.25 mg·L-1组对比，*P<0.05，**P<0.01；与同组内24 h作用时间对比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 LNT作用后miR-138表达量变化

100 mg/L LNT组Huh7.5.1细胞miR-138的相对表达量是对照组细胞(3.05±0.21)倍，显著高于对照组细胞(P<0.05)。提示：100 mg/L LNT可提高Huh7.5.1细胞miR-138表达。

3 讨 论

肝癌临床治疗以手术切除及肝脏移植为主要方法，但治疗效果并不理想，术后复发与转移是影响肝癌预后的重要因素，阻碍肝癌患者的长期生存，导致其5年生存率不足5%[4-5]。LNT为香菇的子实体中提取的一组多糖成分，在肝癌治疗中已经得到认可。实验研究[6-8]表明LNT对肝癌细胞增殖有抑制作用，其机制集中在免疫调节和诱导肿瘤细胞凋亡；临床研究[9-10]也表明LNT联合5-Fu，LNT配合肝动脉化疗塞仃都能明显提高肝癌治疗疗效。本实验通过MTT法检测肝癌细胞增殖，发现不同质量分数LNT对Huh7.5.1细胞增殖有明显抑制作用，且表现为量效、时间依赖性，与其他学者研究结果相符。

miRNAs为一种内源性非编码单链RNA，研究发现其与肝癌密切相关[11]。近年研究[12]表明miRNAs广泛参与中药抗肿瘤作用，因此本实验选择从miRNAs角度探讨LNT对肝癌作用机制。miR-138是近年来新发现的一类具有肿瘤抑制作用的miRNA，可通过靶向多个癌基因抑制肿瘤生长，如miR-138能够靶向调控PDK1基因抑制人结肠癌SW620细胞侵袭抑制[13]；也能通过抑制靶基因hTERT蛋白的表达来抑制人胃腺癌细胞SGC-7901增殖能力[14]；这些结果表明，miR-138是一种重要抑癌miRNA。研究发现miR-138在肝癌患者肿瘤组织中表达水平下调[15]，且Huang[16]和Wang[17]等发现miR-138可通过靶向作用于cyclin D3诱导肝癌细胞周期阻滞，进而影响肝癌细胞生物学行为和临床肝癌患者预后。说明miR-138在肝癌中也同样可以发挥抑癌基因的作用。本实验通过qRT-PCR检测发现LNT组肝癌细胞miR-138表达明显高于对照组(P<0.05)，表明LNT可上调肝癌细胞miR-138表达，抑制细胞增殖。

综上所述，香菇多糖能抑制肝癌细胞增殖作用，其机制可能是提高了肝癌细胞miR-138的表达。此为LNT治疗肝癌提供了新思路。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2017)05-0072-03

R735.7

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.05.31

河南省高等学校重点科研项目计划(13B310176)；南阳市科技攻关项目(2015KJGG020)

2017-03-14；

2017-05-03