体外产气法研究不同NFC/NDF底物条件下外源纤维素酶的适宜添加水平

陈光吉，宋善丹，彭忠利*，王普昶，吴佳海，王小利，郭春华，王子苑，高彦华，李小冬，柏雪，付锡三

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006；3.乐至县科技局，四川 乐至 641500)



体外产气法研究不同NFC/NDF底物条件下外源纤维素酶的适宜添加水平

陈光吉1,2，宋善丹1，彭忠利1*，王普昶2，吴佳海2，王小利2，郭春华1，王子苑2，高彦华1，李小冬2，柏雪1，付锡三3

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006；3.乐至县科技局，四川 乐至 641500)

本试验旨在利用体外产气法研究不同非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维(non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber, NFC/NDF)的底物条件下外源纤维素酶(exogenous fibrolytic enzymes, EFE)对底物产气、降解和发酵特性的影响，找出不同底物条件下适宜的EFE添加水平。采用2×5交叉分组试验设计，5个NFC/NDF底物水平 (0.85、1.02、1.19、1.36和1.53)分别添加5种水平的EFE(0, 2, 4, 8 和16 mg/g DM)进行体外发酵。结果表明，1)不同NFC/NDF底物和EFE水平对体外总产气量(GP48)和产气参数(b、c和L)均有显著的影响(P<0.05)，且两因素互作显著(P<0.05)；底物1中， GP48、b和c值随EFE剂量的增加显著地线性和二次提高(P<0.05)，其中以16 mg/g 水平组较高，L值则呈相反趋势；底物2～4中，GP48、b和c值随EFE剂量增加显著地二次提高(P<0.05)，其中以4 mg/g 水平组较高。2)不同底物对干物质消失率(DMD)、酸性洗涤纤维降解率(ADFD)、中性洗涤纤维降解率(NDFD)和氮降解率(ND)均有显著的影响(P<0.05)，除ND外，EFE水平的添加效应呈现相似结果；底物1条件下，随着EFE添加剂量的提高，DMD、ADFD和NDFD显著地线性提高(P<0.05)，其中均以16 mg/g组最高(P<0.05)；而底物2～4中则以4 mg/g组最高(P<0.05)。3)不同NFC/NDF底物和EFE水平对瘤胃发酵参数均有显著影响(P<0.05)，除丙酸外，两种因素对其他指标的互作效应均显著(P<0.05)；在底物1～4条件下，随着EFE添加剂量的提高，除丙酸以外的其他发酵参数显著地线性和二次提高或降低(P<0.05)；底物1中，对照组pH值、氨态氮含量和丁酸摩尔浓度显著高于4、8和16 mg/g组(P<0.05)，相反，16 mg/g组的总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸摩尔浓度和乙酸∶丙酸值较高；底物2～4条件下，pH值和氨态氮含量以4 mg/g组较低，而TVFA、乙酸摩尔浓度和乙酸∶丙酸值则呈相反的趋势。4)NFC/NDF=1.53时，添加EFE对体外产气参数、降解特性和发酵特性均无显著影响(P>0.05)。由此，本试验发现，NFC/NDF底物影响了EFE的添加效应，NFC/NDF=0.85时，16 mg/g EFE水平组有较好纤维降解效果；NFC/NDF分别为1.02、1.19和1.36时，EFE最适添加剂量为4 mg/g；NFC/NDF=1.53时，底物中添加EFE没有正面效应。

体外产气法；NFC/NDF；外源纤维素酶；适宜添加水平

反刍动物日粮中，纤维素和半纤维素是最重要的结构性碳水化合物，瘤胃微生物可以产生催化水解这些碳水化合物的酶，但是这两种碳水化合物复杂而致密的网状结构制约了反刍动物对它们的消化和利用。为了克服这种因素，很多学者做出了巨大努力，其中外源纤维素(exogenous fibrolytic enzymes, EFE)在反刍动物日粮中的作用研究较多[1-2]，然而据文献报道其结果不尽相同[3-4]。这是由于EFE的作用效果受诸多因素的影响，包括酶的类型和添加量、动物饲粮的类型和动物的生产水平等[5-6]。因此，研究EFE在反刍动物日粮中的适宜添加条件，对深入了解日粮因素与酶添加形式的内在关联，以及合理利用EFE来提高日粮结构性碳水化合物利用率具有重要的作用。就日粮因素而言，酶的作用效果因粗料的类型[7-8]、酶的应用方法[9-10]以及日粮的结构[5]不同而异。在日粮结构因素中，长期以来，人们仅以日粮精粗比这一指标来衡量反刍动物的日粮营养水平，但因它不能精准有效反映反刍动物日粮的碳水化合物组成而显得过于笼统[11]。与日粮精粗比这个概念相比，非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维 (non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber, NFC/NDF)的比值不仅能准确反映日粮的碳水化合物的结构，也是反映反刍动物瘤胃亚急性酸中毒(subacuteruminal acidosis，SARA)的重要指标[12]。然而，目前还未见国内外有关于日粮NFC/NDF是否影响EFE的作用效果的报道。

本试验利用体外产气法，在不同NFC/NDF的底物条件下，研究不同添加量的EFE对底物的产气特性、降解特性和发酵特性变化的影响，进一步探究日粮结构与EFE是否存在互作效应，以期找出不同碳水化合物组成条件下适宜的EFE添加水平，为EFE在山羊日粮中的合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 底物及复合纤维素酶

底物由精料和粗料两部分组成，粗料为苜蓿(Medicagospp.)草粉和玉米(Zeamays)青贮饲料(2015年7月采集于四川省乐至县天龙农牧科技有限公司)，配制混合底物前将粗料在60 ℃下烘48 h，过1 mm筛后与精料配合成NFC/NDF分别为0.85、1.02、1.19、1.36和1.53的混合底物，原料的各营养指标均为实测值，底物原料组成和营养成分见表1。

表1 试验底物组成及营养成分Table 1 Ingredients and chemical composition

注：原料组成为风干基础，营养成分为干物质基础。

Note: Ingredient composition with air dried basis and nutrient composition with DM basis.

EFE为纤维素酶和木聚糖酶的复合粉剂，购自上海尤特尔生化有限公司。试验前，参照Colombatto等[13]的方法测定了外源酶的纤维素酶和木聚糖酶活力：在pH为5.5和39 ℃条件下，纤维素酶和木聚糖酶活力分别为8563.50 IU/g和3585.6 IU/g。

1.2 瘤胃液采集

2015年9月在四川省乐至县天龙农牧科技有限公司种羊场选取6只体重接近[(25±0.32) kg]的健康川中黑山羊(乐至型)育肥公羊，在精粗比为50∶50的日粮条件下饲喂两个月后，于晨饲前屠宰取瘤胃液。将每头羊瘤胃液混合并用6层0.125 mm纱布过滤后立即装入保温瓶中通入CO2保持厌氧条件，迅速带回实验室进行体外产气试验。

1.3 试验设计

采用2因子5水平试验设计，底物的NFC/NDF和EFE添加水平作为两个试验因素。 NFC/NDF分别为0.85、1.02、1.19、1.36和1.53，EFE添加量分别为：0, 2, 4, 8和16 mg/g DM，即底物纤维素酶活力含量分别为0, 17, 34, 68, 136 IU/g DM；木聚糖酶活力含量分别为0, 7, 14, 28, 56 IU/g DM。试验共25个处理，每个处理3个重复。

1.4 体外产气试验

参照Menke[14]的方法配制缓冲液，将其置于39.5 ℃的恒温培养箱中，持续通入CO2，现配现用。准确称取500 mg EFE 溶于缓冲液中(pH=6.5)，用玻璃棒搅拌均匀，配制成浓度为5 mg/mL的酶溶液，现配现用，试验前将酶溶液放入恒温水浴锅中37 ℃水浴30 min。分别准确称取700 mg底物并用移液枪吸取相应量的酶液置于100 mL玻璃刻度注射器底部(成都圣欣科学仪器有限公司)，然后吸入50 mL预先于39.5 ℃恒温水浴锅保温的混合培养液[瘤胃液∶人工唾液=1∶4(V/V)]，轻微震荡摇匀后置于(39±0.5) ℃的恒温培养箱中培养48 h。每个处理3个重复，设置一个空白对照管(仅含有混合培养液)以减少系统误差；每个重复设置3个平行，发酵结束后将同一个处理的3个平行样品中的液相和固相分别混合后取样，以防止剩余的干物质量不足以测定后续指标。

发酵过程中，记录3, 6, 9, 12, 18, 24, 30, 36, 40, 48 h时间点的产气量，记录过程中每间隔2 h摇匀一次(由于剧烈发酵后会出现固液相分开的现象)，产气量刻度超过80 mL后推动活塞至初始刻度。培养48 h后立即用冰水浴终止发酵，将同一个处理的3个平行样品中的培养液无损的移至50 mL离心管中，立即用PHB-5型便携式pH计(杭州天威工贸有限公司)测定培养液pH值；然后吸取1 mL培养液进入2 mL EP 管中加入1 mL 100 g/L的偏磷酸用于挥发性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)含量的测定(气相色谱外标法，日本岛津CMG-QP2010，色谱柱CP-WAX：长 30 m，内径 0.53 mm，膜厚 1 μm)，乙酸、丙酸及正丁酸标准品(色谱纯)均购于Sigma公司；另取1 mL培养液加入1 mL 0.5 mol/L的HCl用于氨态氮(NH3-N)含量的分析(分光光度计购自上海安谱科学仪器有限公司，DR/5000)。最后将离心管于3000 r/min下离心15 min，并用热水洗涤培养液固相残留物，然后无损的转移至预先恒重的轻质铝盒中，于65 ℃烘箱中烘48 h，然后将同一处理的3个平行风干样混合，用于干物质消失率(dry matter disappearance rate, DMD)、酸性洗涤纤维降解率(acid detergent fiber degradation rate, ADFD)、中性洗涤纤维降解率(neutral detergent fiber degradation rate, NDFD)和氮降解率(nitrogen degradation rate, ND)的测定。

1.5 指标测定及计算方法

各处理底物和培养液固相残留物中DM、Ash和N含量的测定参照张丽英[15]的方法， ADF和NDF含量参照Van Soest等[16]的方法进行测定。培养液中VFA和NH3-N含量参照Carro等[17]的方法测定。

其中VFA测定的色谱条件：载气为氦气，流量为2 mL/min，分流比为10∶1。采用程序升温，初始温度为120 ℃，以8 ℃/min升温至180 ℃，保持5 min，离子源温度为230 ℃。进样口温度为210 ℃，进样量为1 μL。

1.5.1 产气量的计算

产气量(mL)=该时间段内培养管产气量(mL)-对应空白管产气量(mL)

1.5.2 产气动力学参数 参照France等[18]提出的计算模型:GP=b×[1-e-c(t-L)]，调用SPSS 18.0 统计软件中非线性回归程序(Nonlinear)进行产气参数估计。式中：GP表示培养t时间点的产气量(mL)，e为自然对数，t为培养时间(h)，b为潜在最大产气量(mL/g DM)，c表示产气速率(mL/h)，L表示开始产气前的延滞时间(h)。

1.5.3 DMD、 ADFD、 NDFD和 ND计算方法

DMD (%)=(A-B)/A×100

式中：A为发酵前样品干物质重；B为发酵48 h后残渣干物质重。

ADFD (%)=(ADF前×A-ADF后×B)/ADF前×A×100

式中：ADF前为发酵前的ADF含量；ADF后为发酵48 h后ADF的含量；NDFD和ND的计算方法与ADFD的计算方法相同。

1.6 统计方法

将不同NFC/NDF水平和EFE添加水平作为两个因素，用SPSS 18.0 统计软件中一般线性模型(general linear models, GLM)，选用交互模型进行两因素方差分析，分别得出两个因素对各项体外发酵参数指标的主效应和互作效应；再调用GLM程序分别对各个底物不同酶水平进行单因素方差分析，并采用Duncan’s法进行多重比较，然后用线性估计(curve estimation)程序对相同底物下不同酶水平的试验结果进行线性(Linear)和二次函数(Quadratic)的显著性检验。以P<0.05代表差异显著性的判断标准，结果用平均值表示，变异程度用标准误(SEM)表示。

2 结果与分析

2.1 体外产气参数

由表2可见，不同NFC/NDF底物和EFE水平对体外总产气量(GP48)和产气参数(b、c和L)均有显著的影响(P<0.05)；且两因素互作显著(P<0.05)。相同底物条件下，底物1中， GP48、b和c值随EFE剂量增加显著地线性和二次提高(P<0.05)，其中以16 mg/g 水平组较高，L值则显著地线性降低(P<0.05)，同样以16 mg/g 水平组最低；底物2中，GP48、b和c值随EFE剂量增加显著地二次提高(P<0.05)，其中以4 mg/g 水平组较高，底物3和底物4呈相似的趋势；底物5中，EFE添加水平对GP48和产气参数无显著影响(P>0.05)。

续表2 Continued Table 2

注：同列数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。1)底物分别表示NFC/NDF为0.85、1.02、1.19、1.36和1.53。下同。

Note: Different letters in the same column mean significant differences between the treatments (P<0.05), same letter in the same column or no letter means not significant difference between treatments (P>0.05).1)The substrates showed that the NFC/NDF ratio were 0.85, 1.02, 1.19, 1.36 and 1.53, respectively. The same below.

2.2 底物降解特性

从表3可知，不同底物对DMD、ADFD、NDFD和ND均有显著的影响(P<0.05)，除ND外，EFE水平的添加效应呈现相似结果。底物1条件下，随着EFE添加剂量的提高，DMD、ADFD和NDFD显著地线性提高(P<0.05)，其中均以16 mg/g组最高；底物2～底物4中，随着EFE添加剂量的提高，DMD、ADFD和NDFD显著地二次函数提高(P<0.05)，其中均以4 mg/g组最高；底物5条件下，EFE添加剂量对底物降解特性没有显著影响(P>0.05)。

表3 不同NFC/NDF底物条件下不同EFE水平对底物降解特性的影响Table 3 Effects of different levels of exogenous fibrolytic enzymes on the degradation characteristics of substrates with different NFC/NDF ratios %

续表3 Continued Table 3

2.3 瘤胃发酵参数

由表4可看出，不同NFC/NDF底物和EFE水平对瘤胃pH、氨态氮含量、总挥发性脂肪酸(total voltatile fatty acid,TVFA)浓度、乙酸、丙酸、丁酸摩尔浓度和乙酸∶丙酸值均有显著影响(P<0.05)，除瘤胃丙酸外，两种因素对其他瘤胃发酵参数均有显著的互作效应(P<0.05)。在底物1～4条件下，随着EFE添加剂量的提高，除丙酸和丁酸外，各发酵参数显著地线性或二次提高或降低(P<0.05)。底物1中，对照组pH值、氨态氮含量和丁酸浓度显著高于4、8和16 mg/g组(P<0.05)，相反，16 mg/g组的TVFA和乙酸浓度显著高于其他各组(P<0.05)，乙酸∶丙酸值同样以16 mg/g EFE水平组较高，与4 mg/g组差异不显著(P>0.05)；底物2、底物3和底物4条件下，pH值和氨态氮含量以4 mg/g组较低，而TVFA、乙酸摩尔浓度和乙酸∶丙酸值则呈相反的趋势；底物5中，EFE添加剂量对发酵参数无显著影响。

表4 不同NFC/NDF底物条件下不同外源酶水平对瘤胃发酵参数的影响Table 4 Effects of different levels of exogenous fibrolytic enzymes on the rumen fermentation parameters of substrates with different NFC/NDF ratios

续表4 Continued Table 4

3 讨论

3.1 不同NFC/NDF的底物条件下EFE水平对体外产气量、产气参数和底物降解特性的影响

反刍动物瘤胃内含有能分解纤维类物质的极为复杂的微生物体系，微生物在发酵饲粮后会代谢产生由CH4、NH3、CO2、H2和N2等组成的混合气体，故产气量综合体现了发酵底物被微生物利用的程度。许多研究表明，在反刍动物日粮中添加外源酶制剂，可以促进酶与底物结合，从而提高饲料的利用率[19-21]。但对EFE能否提高或者降低GP，报道的结果却不尽相同。Eun等[20]的体外发酵研究结果显示，在苜蓿干草中添加内切及外切葡聚糖酶、木聚糖酶以及蛋白酶均能促进苜蓿干草的GP48累积，同时还提高了苜蓿干草的DMD及纤维降解率。Yang等[22]利用体外发酵研究外源酶制剂对以苜蓿和稻草秸秆为发酵底物的降解率的影响，结果表明，与对照组相比，添加酶制剂可以提高48 h的总GP，并能促进DM和纤维的降解。本研究中，在各底物条件下，EFE水平对GP48、体外潜在最大产气量(b值)和产气速率(c值)均有显著的线性或二次函数的影响，但趋势不尽相同，随着EFE添加量的递增，GP出现先增加后减少的趋势，即EFE水平过高GP48反而降低，这正如Elghandour等[23]的观点所述，只有适宜的EFE添加水平方能提高瘤胃发酵效率。而Nsereko等[24]认为在同样饲粮条件下，适宜的EFE水平能改善瘤胃的发酵效率或刺激瘤胃良性发酵，从而提高GP、c值及底物降解率。但也有研究认为酶制剂的添加对产气量几乎没有影响[18]。产生不一致的原因可能是酶添加剂量的不同以及适合与不同底物所匹配的酶不一样。

尽管反刍动物瘤胃微生物能分泌大量可以破坏纤维素及半纤维素中糖苷键的酶，但许多研究均证实添加EFE可提高纤维的降解[21]。从本试验中GP48的差异便可推知，与对照组相比，添加EFE可促进纤维降解。此外，本试验还发现，当NFC/NDF=0.85时，添加16 mg/g的EFE具有较高的GP和纤维降解率，而底物NFC/NDF分别为1.02、1.19、1.36时，添加4 mg/g EFE则效果更好，这表明底物NFC/NDF与EFE的添加水平存在互作效应。其原因则要追溯到EFE的作用机理上，EFE对纤维素进行降解首先要吸附到纤维素上，纤维素酶分子通过纤维素结合域吸附到纤维素晶体表面，然后催化结构域催化糖苷键的断裂从而实现纤维素的降解。而NDF含量高的底物具有较大的纤维素晶体表面积，从而可吸附更多的纤维素结合域，因此有更高水平的纤维素酶能发挥作用[25]。此外，本试验中，在不同底物里添加EFE对ND无显著影响。此结果与Awawdeh等[26]报道的在羔羊饲粮中添加EFE，对羔羊氮利用率和氮沉积率无影响的结果一致。相反，Gado等[19]在奶牛的饲喂试验中得出不同的结果，在奶牛饲粮中添加40 g/d的EFE，提高了饲粮N利用率。造成这些结果不一致的原因可能是纤维素酶的来源不同(Gado等[19]所使用的EFE为瘤胃厌氧菌培养产生)，还可能与动物品种差异有关，因此在具体应用时，要根据酶制剂和动物类型进行合理选择。

3.2 不同NFC/NDF的底物条件下EFE对瘤胃发酵参数的影响

pH值是反应反刍动物瘤胃发酵水平最直观指标，大量研究证实，瘤胃液中VFA浓度的增加是导致pH下降的主要因素，其次为乳酸[27-28]。本试验研究表明，在底物1～4条件下，TVFA浓度随EFE水平的提高呈线性或二次函数升高的趋势，这可能是导致pH值线性或二次降低的原因，本试验中底物1～4条件下，培养液pH值在5.83～6.52，而高于亚急性瘤胃酸中毒(SARA)5.5～5.8的阀值[29]，而在底物5中，pH值在5.73～5.88，接近SARA阀值，原因可能是本试验采用的体外培养装置不是连续型培养系统，随着培养时间的延长，培养管内VFA和乳酸等物质积累而无法吸收和排出导致pH值处于较低的水平。另外，TVFA的浓度的高低依赖于底物碳水化合物的结构和降解程度，在同样的NFC/NDF条件下，本试验中EFE水平影响了DMD、ADFD和NDFD，故影响了TVFA，这与Arriola等[30]的结果一致，而不同的底物条件下的TVFA结果和相应降解特性结果相吻合，即底物1条件下，以16 mg/g EFE水平组较高，底物2～4以4 mg/g酶水平较高。对于单VFA，除底物5外，其余底物处理组中，乙酸摩尔浓度的变化趋势与TVFA基本一致，丁酸呈相反趋势，而丙酸摩尔浓度未发生显著变化，导致乙酸∶丙酸值出现相应的变化，即随着底物碳水化合物降解率的提高，VFA中乙酸比例提高，丙酸不变，丁酸比例降低，乙酸∶丙酸值提高，可见，酶水平改变了瘤胃的发酵模式，这与Giraldo等[31]和Romero等[32]报道的结果一致。

值得注意的是，当NFC/NDF=1.53(底物5)时，酶水平未影响底物产气特性、降解特性和发酵特性，这可能是当NFC/NDF提高到一定值时，快速发酵的碳水化合物含量过高，迅速发酵后促使培养液pH快速降低从而抑制了纤维类降解菌的生长[33]，而同时外源纤维素酶吸附到结构性碳水化合物上后首先催化致密的纤维结构变得疏松而部分水解，但水解产物并没有完全被降解纤维类的微生物所利用，而影响了产气特性和降解特性。瘤胃中氨氮浓度是反应饲粮代谢的重要指标，是瘤胃微生物可利用的主要氮源，在同样的日粮蛋白质水平下，瘤胃中氨态氮浓度越低表征微生物利用率越高，菌体蛋白产量越高[34]。本试验结果表明，各NFC/NDF的底物条件下，瘤胃液中氨态氮含量变化趋势与相应TVFA的趋势一致，即底物1条件下呈线性和二次函数降低的趋势，以16 mg/g 外源酶水平组最低，底物2～4均以4 mg/g酶水平较低，说明瘤胃氨态氮的利用率分别在上述酶水平条件下较高，原因可能是适宜的酶水平提高了结构性碳水化合物的降解率，从而产生较高的TVFA浓度，为微生物的生长提供更多的可利用能进而提高了氨态氮利用率[35]。

4 结论

本试验条件下， NFC/NDF底物影响了EFE的添加效应，NFC/NDF=0.85时，16 mg/g EFE水平组有较好纤维降解效果；NFC/NDF分别为1.02、1.19和1.36时，EFE最适添加剂量为4 mg/g；NFC/NDF=1.53时，底物中添加EFE没有正面效应。

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Determination of appropriate levels of exogenous fibrolytic enzyme supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrate/neutral detergent fiber ratios based oninvitrogas production

CHEN Guang-Ji1,2, SONG Shan-Dan1, PENG Zhong-Li1*,WANG Pu-Chang2, WU Jia-Hai2, WANG Xiao-Li2, GUO Chun-Hua1, WANG Zi-Yuan2, GAO Yan-Hua1, LI Xiao-Dong2, BAI Xue1, FU Xi-San3

1.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestMinzuUniversity,Chengdu610041,China; 2.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 3.BureauofScienceandTechnology,SichuanProvince,Lezhi641500,China

The objective of this study was to determine the appropriate level of exogenous fibrolytic enzyme (EFE) supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber (NFC/NDF) ratios. The experiment had a cross group design with two factors and five levels. Five substrates with different NFC/NDF ratios (0.85, 1.02, 1.19, 1.36, and 1.53; sub1-5) were supplemented with EFE at five levels (0, 2, 4, 8, and 16 mg/g dry matter/DM) andinvitrogas production, degradation, and fermentation profiles were determined. The results can be summarized as follows: 1) The NFC/NDF ratio influenced totalinvitrogas production (GP48) and gas production parameters (b, c, and L) (P<0.05). The interaction between NFC/NDF ratio and EFE level was significant for gas production parameters (P<0.05).In sub1, as the EFE level increased, GP48, b, and c increased (linear and quadratic effect,P<0.05), and the highest GP48, b, and c were in the 16 mg/g EFE treatment; L showed the opposite trend. In the sub2-4 treatments, the highest GP48, b, and c were in the 4 mg/g EFE treatment. 2) The NFC/NDF ratio in the substrate significantly affected the dry matter disappearance rate (DMD), acid detergent fiber degradation rate (ADFD), neutral detergent fiber degradation rate (NDFD), and nitrogen degradation rate (ND) (P<0.05). The additive effects of EFE produced similar results, except for ND. In sub1, as the EFE dose increased, DMD, ADFD, and NDFD linearly increased (P<0.05). The maximum values of DMD, ADFD, and NDFD were in the 16 mg/g EFE treatment in sub1 and in the 4 mg/g EFE treatment in sub2-4 (P<0.05). 3) The fermentation profile differed significantly among substrates with different NFC/NDF ratios and different levels of EFE supplementation (P<0.05), and the two factors had a significant interaction effect (P<0.05) for all fermentation parameters, except for propionate. For sub1-4, as the EFE levels increased, the fermentation profiles of all parameters except for propionate increased or decreased (quadratic effect,P<0.05). In sub1, pH, ammonia-N, and the butyrate molar concentration were higher in the control group than in the 4, 8 and 16 mg/g EFE treatments, but the acetate molar concentration and acetate∶propionate ratio were higher in the 16 mg/g EFE treatment. The sub2-4 treatments showed lower pH and ammonia-N, and higher total volatile fatty acid (TVFA), acetate molar concentration, and acetate∶propionate ratio. 4) In the substrate with NFC/NDF=1.53, EFE supplementation had no effect oninvitrogas production, fiber degradation, or fermentation characteristics (P>0.05). The results of this study showed that the NFC/NDF ratio influenced the response to EFE supplementation; NFC/NDF=0.85, 16 mg/g EFE showed the best fiber degradation, and the optimum EFE dose was 4 mg/g for substrates with NFC/NDF ratios of 1.02, 1.19, and 1.36. There was no positive effect of EFE on the substrate with NFC/NDF=1.53.

invitrogas production; NFC/NDF; exogenous fibrolytic enzymes; appropriate supplementary dose

10.11686/cyxb2017055

2017-02-20；改回日期：2017-04-10

“科技部科技富民强县专项：川中黑山羊(乐至型)健康养殖关键技术集成与示范”，科技创新人才团队建设项目“贵州省喀斯特山区草地培育与养殖管理科技创新人才团队”(黔科合平台人才[2016]5617)和黔科合重大专项字(2014)6017号资助。

陈光吉(1990-)，男，贵州遵义人，硕士。E-mail:cgjgz09@126.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: leo3131@163.com

http://cyxb.lzu.edu.cn

陈光吉, 宋善丹, 彭忠利, 王普昶, 吴佳海, 王小利, 郭春华, 王子苑, 高彦华, 李小冬, 柏雪, 付锡三. 体外产气法研究不同NFC/NDF底物条件下外源纤维素酶的适宜添加水平. 草业学报, 2017, 26(7): 116-127.

CHEN Guang-Ji, SONG Shan-Dan, PENG Zhong-Li, WANG Pu-Chang, WU Jia-Hai, WANG Xiao-Li, GUO Chun-Hua, WANG Zi-Yuan, GAO Yan-Hua, LI Xiao-Dong, BAI Xue, FU Xi-San. Determination of appropriate levels of exogenous fibrolytic enzyme supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrate/neutral detergent fiber ratios based oninvitrogas production. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 116-127.