响应面法优化柠檬酸去除香菇中镉工艺

胡 静，孙君社，谭晓妍，胡绍峰，秦子芳，宁慧娟，张秀清,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.农业部规划设计研究院，北京 100125）

响应面法优化柠檬酸去除香菇中镉工艺

胡 静1，孙君社2，谭晓妍1，胡绍峰1，秦子芳1，宁慧娟1，张秀清1,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.农业部规划设计研究院，北京 100125）

为降低香菇中重金属镉的含量，本实验以干香菇为原料，采用柠檬酸为洗脱剂去除香菇中的重金属镉，并对去除方法进行优化。通过单因素试验和响应面优化方法，分析柠檬酸浓度、pH值和转速对香菇中镉去除率的影响。结果表明，采用柠檬酸作为洗脱剂，在浓度0.32 mol/L、pH 5.0、30 ℃、转速70 r/min条件下，香菇中镉的去除率达到最大，为57.0%，去除后香菇中镉残留量最高为0.41 mg/kg，低于国家限量标准0.5 mg/kg。同时采用该方法处理后，香菇中多糖及蛋白质含量损失少，较好地保留了香菇中的营养成分。该方法对降低香菇中镉的残留具有一定的应用参考价值。

香菇；镉；柠檬酸；响应面

香菇（Lentinus edodes）为世界第二大食用菌，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，侧耳科，香菇属，是一种木腐性真菌[1]，主要分布在亚洲东南部，属于热带亚热带环境中的真菌微生物[2]。香菇肉质肥厚，味道鲜美，营养丰富，是我国重要的药食同源真菌[3]。同时香菇中也含有丰富的药效成分，如香菇多糖、香菇嘌呤及三萜类化合物等[4]，具有抗病毒[5]、抗肿瘤[6-7]、抗氧化[8-10]、降血脂[11-14]等功效，常用于临床治疗中的辅助治疗[15]。

目前香菇生产多采用袋料栽培方式，但是在生长过程中香菇会富集袋料中的重金属，其重金属含量与栽培环境、栽培基质和自身机制有关[16-17]，大多数重金属通过被动运输进入组织[18-19]。Schlecht等[20]研究发现食用菌对镉的富集效果较为显著，其镉的富集量为蔬菜的10 倍。贾彦[21]分析了北京市食用菌重金属含量，发现部分地区香菇样品镉超标率达42.5%。食用菌中镉主要分布在细胞壁上，其次分布在细胞质和液泡中[22]。2015年新颁布的中华人民共和国供销合作行业标准GH/T 1013—2015《香菇》中规定干菇中镉（以Cd计）的限量标准为0.5 mg/kg。

针对香菇中重金属镉含量较高的情况，目前多从栽培香菇的袋料着手，控制原料的重金属含量或添加外源物质控制香菇中重金属含量。边银丙[23]在袋料配方中提高石膏用量，通过钙离子的竞争及pH值的改变，能有效降低香菇中镉含量34%～45%。吴学谦[24]改变香菇培养料为50%～89%的斜发沸石粉、9%～42%的石灰石粉或石膏粉和2%～8%的硫酸镁，可使栽培的香菇中重金属含量降低10%～50%。但是当前研究中对于采收后香菇子实体重金属镉的去除方法研究较少。柠檬酸作为一种有机酸，是常用的食品添加剂，也可作为环境友好型淋洗剂，在温和酸性条件下可以络合重金属离子，以达到去除重金属的效果，而且柠檬酸在好氧及厌氧条件下均可被生物降解[25]。单恩莉等[26]利用酶解结合柠檬酸浸泡处理对东海乌参中重金属进行去除，去除率达90%以上，且去除前后东海乌参中脂肪、蛋白质、多糖成分无显著变化。丁仲仲[27]利用柠檬酸去除坛紫菜中重金属，去除效果良好，且去除前后坛紫菜感官和品质无明显变化。Wang Yi等[28]利用柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）和活性炭共同作用，对香菇多糖中重金属镉进行去除，去除效果良好。

本研究以柠檬酸为洗脱剂，通过单因素试验考察柠檬酸浓度、pH值及转速[29-32]对香菇中镉去除率的影响，在此基础上利用响应面分析法对镉去除方法进行优化，得到柠檬酸去除镉的适宜方法条件。同时对处理前后香菇中蛋白质和多糖含量进行了测定，较好地保留了香菇中的有效成分，得到了营养丰富、重金属含量符合标准的香菇。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取不同主产地、镉含量较高的香菇伞为实验材料，为了便于后续加工，将香菇进行切片处理。

100 mg/L镉标准溶液 百灵威科技有限公司；苯酚、硫酸、硝酸、葡萄糖、氯化镉、无水乙醇、柠檬酸、硫酸钾、硫酸铜、甲基红、EDTA、硼酸、氢氧化钠、过氧化氢、溴钾酚绿均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SPD50型自动凯式定氮仪、SPT20消解炉 北京三品科创仪器公司；ICP 6300电感耦合等离子体发射光谱仪 美国Thermo Fisher公司；MARS 5. MARS 6微波消解仪 美国CEM公司；TM-1901型双光束紫外-可见光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；摇床太仓豪成仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 镉去除工艺流程

香菇伞→均匀切片（厚度1～5 mm）→加入洗脱剂（选择合适的洗脱剂浓度、pH值、转速）→摇床洗脱→烘干、粉碎→镉含量测定。

1.3.2 香菇中重金属镉的测定

采用微波消解系统消解样品，于电感耦合等离子体发射光谱仪中测定香菇中镉含量。镉去除率的计算公式如下所示：

式中：C0为处理前香菇中镉含量/（mg/kg）；C为处理后香菇中镉含量/（mg/kg）。

1.3.3 洗脱剂的确定

本实验选取水、柠檬酸溶液及 EDTA溶液分别作为香菇中重金属镉的洗脱剂，主要考察这3 种洗脱剂去除香菇中重金属镉的效果。选择料液比1∶10、浓度0.16 mol/L、pH 6.0、转速150 r/min实验条件，通过比较香菇中重金属镉的去除率确定最佳洗脱剂。

1.3.4 单因素试验

选取上述实验选定的溶液作为单因素试验的洗脱剂，以蒸馏水处理为对照组（CK），分别考察洗脱剂浓度、pH值和转速3个因素对重金属镉去除率的影响。

1.3.5 响应面试验优化

通过单因素试验确定影响镉去除率的主要因素和最佳水平范围，根据响应面中的Box-Behnken原理，选择洗脱剂浓度、pH值和转速3 个因素，设计三因素三水平试验，响应面试验因素水平如表1所示。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the independent variables used in response surface design

1.3.6 蛋白质与多糖含量的测定

根据GB/T 15673—2009《食用菌中粗蛋白含量的测定》和NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的测定》，采用凯氏定氮法和苯酚-硫酸法对处理前后的香菇进行蛋白质和多糖含量的测定。

2 结果与分析

2.1 洗脱剂的确定

在料液比1∶10、洗脱剂浓度0.16 mol/L、pH 6.0、转速150 r/min的条件下，分别选用不同的洗脱剂对香菇中重金属镉进行去除，探讨不同洗脱剂对重金属镉去除率的影响，结果如图1所示，蒸馏水对香菇中重金属镉的去除率仅为10.4%，相比而言，EDTA和柠檬酸对镉去除率较高，去除率分别为55.4%和40.1%。但EDTA对眼睛、皮肤有一定刺激作用，GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中规定EDTA在食品中最大添加量为0.25 g/kg，而且EDTA作为吸附剂时，具有广泛的配位性能，几乎能与所有金属离子形成配合物[33]，易对香菇中营养成分造成损失。柠檬酸作为低分子质量有机酸的一种，不仅本身可生物降解，而且对重金属的解吸具有明显的促进作用[34]，因此实验选择柠檬酸作为镉的去除剂。

图1 不同溶剂对镉洗脱率的影响Fig. 1 Effects of different solvents on the removal of cadmium

2.2 单因素试验结果

图2 3 种因素对镉去除率的影响Fig. 2 Effects of three factors on the removal rate of cadmium

在柠檬酸pH 6.0、转速150 r/min的条件下，分别按照柠檬酸浓度为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 mol/L进行香菇中重金属镉的去除，探讨柠檬酸浓度对香菇中重金属镉去除率的影响。由图2A可知，随着柠檬酸加入量的不断增大，镉的去除率逐渐增大，这可能是因为增加柠檬酸浓度可以增加扩散速率，使柠檬酸与镉离子形成稳定的络合物[34]，从而降低香菇中镉的含量。当柠檬酸浓度为0.32 mol/L时去除率达到49.0%，浓度为0.16 mol/L时去除率为47.1%。

在柠檬酸浓度0.16 mol/L、转速150 r/min的条件下，分别按照柠檬酸pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0进行香菇中重金属镉的去除，探讨柠檬酸pH值对香菇中重金属镉去除率的影响。由图2B可知，随着溶液pH值的降低，香菇中镉去除率不断提高，这可能是因为低pH值条件下，镉的去除效率主要受到质子运动的影响，随着pH值的升高，溶液中的质子数逐渐减少，此时，去除效率取决于酸根对重金属的络合能力[27]。在中等酸性条件下，柠檬酸对重金属镉的络合作用效果较好。

在柠檬酸浓度0.16 mol/L、pH 6.0的条件下，分别按照转速为50、100、150、200、250 r/min进行香菇中重金属镉的去除，探讨转速对香菇中重金属镉去除率的影响。由图2C可知，转速对去除率影响差异显著，提高摇床转速，可以加快镉离子的扩散速率，提高去除效果。转速在100 r/min时，去除率达到最高，为43.7%。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计与结果

表2 响应面试验分析结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

根据单因素试验结果，选择柠檬酸浓度、柠檬酸pH值和转速为考察因素，使用Design-Expert 8.0软件，以镉去除率为指标，设计三因素三水平的响应面试验，响应面试验结果如表2所示。通过对表2数据进行多元回归拟合，得到回归方程为：对拟合的模型进行方差分析及回归系数的显著性检验，结果见表3。模型P值小于0.05，即表明该模型显著，失拟项不显著（P=0.2333＞0.05），说明残差是由随机误差引起的；模型决定系数R2=0.86，说明模型对试验拟合程度较好，能够真实地反映各影响因素与响应值之间的关系，因此可以利用该方程对香菇中重金属镉的去除率进行分析和预测。模型中A对响应值的影响显著

（P＜0.05），说明柠檬酸浓度是影响香菇中重金属镉去除率的重要控制因素；3 个因素对镉去除率的影响大小依次为柠檬酸浓度＞pH值＞转速。

2.3.2 柠檬酸去除香菇中镉的响应面分析

图3 各因素交互影响镉去除率的响应面图Fig. 3 Response surface plots showing the effect of various factors on the removal rate of cadmium

观察图3中各因素之间两两相互作用的响应面图形，分析其对香菇重金属镉去除率的影响。以图3b为例，等高线呈椭圆形，说明柠檬酸浓度和转速的交互作用对镉的去除率影响较大。在所涉及的实验条件范围内，固定柠檬酸浓度，随着转速的不断增加，镉的去除率呈现先上升后下降的变化趋势。固定转速，镉的去除率呈先上升后趋于平稳的趋势。

2.3.3 最佳方法条件的确定与验证

利用Design-Expert 8.0软件分析得出最大响应值对应的因素条件为柠檬酸浓度0.32 mol/L、pH 5.0、转速70 r/min，且模型预测重金属镉去除率为59.6%。为证实预测结果，按最佳去除方法条件重复实验3 次，得到重金属镉去除率为57.0%，镉的残留量为0.41 mg/kg，低于国家限量标准0.5 mg/kg。实测值与预测值之间偏差较小，因此说明应用响应面法优化得到的提取条件是准确可靠的。

2.4 柠檬酸洗脱对香菇有效成分的影响

图4 不同香菇样品镉去除率Fig. 4 Removal rate of cadmium from different Letinous edodes samples

对于不同的香菇样品，采用优化得到的方法进行重金属镉的去除，结果如图4所示，3 种香菇镉含量均有明显降低，平均去除率为52.4%。采用凯氏定氮法和苯酚-硫酸法对香菇中蛋白质和多糖的含量进行测定（图5），未经处理的香菇蛋白质含量为24.3%，处理后的香菇蛋白质含量为21.3%，仅降低3%；未处理的香菇多糖含量为8.37%，处理后的香菇多糖含量为8.04%，仅降低0.33%，洗脱前后香菇中多糖、蛋白质含量无显著性差异，较好地保留了香菇中的营养成分。

图5 最佳工艺条件对营养成分的影响Fig. 5 Effect of the optimized treatment for cadmium removal on nutrient retention

3 结 论

香菇作为一种营养丰富的食用菌，备受人们青睐，但是重金属镉污染问题日益严重，影响了香菇市场的进一步发展，因此研究其重金属镉的去除方法具有重要的实际价值。本研究通过单因素试验和响应面试验，对柠檬酸洗脱去除香菇重金属镉的方法进行了优化，得到采用柠檬酸作为洗脱剂，在浓度0.32 mol/L、pH 5.0、 30 ℃、转速70 r/min条件下，香菇中镉的去除率达到最大，去除率为57.0%，相当于0.16 mol/L EDTA处理时所得到的去除率。随后将该方法应用到不同香菇样品中，结果显示镉去除率均在48%以上，平均去除率为52.4%，且去除后香菇中镉含量均符合国家限量标准；该方法处理前后香菇中蛋白质和多糖含量无显著性差异，对香菇营养成分没有造成明显损失。本实验得到的香菇镉的去除方法能显著降低香菇中镉的含量，对现实生产具有一定的指导意义。

[1] 高兴洋, 安辛欣, 赵立艳, 等. 真空低温油炸和真空冷冻干燥对香菇脆片品质及挥发性风味成分的影响[J]. 食品科学, 2015, 36(17): 88-93. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201517017.

[2] 李月梅. 香菇的研究现状及发展前景[J]. 微生物学通报, 2005, 32(4): 149-152. DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2005.04.030.

[3] 李小凡, 王常青, 訾艳, 等. 香菇柄中水溶性蛋白的提取及组成分析[J]. 食品工业科技, 2015, 36(9): 343-345. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2015.09.066.

[4] 元向东. 香菇菌丝体多糖的化学结构与抗氧化活性分析[J]. 食品与发酵工业, 2016, 42(8): 203-207. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ ts.201608036.

[5] ZHAO Y M, WANG J, WU Z G, et al. Extraction, purification and anti-proliferative activities of polysaccharides from Lentinus edodes[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 93: 136-144. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.05.100.

[6] 乔艳明, 陈文强, 解修超, 等. 响应面法优化香菇胞外多糖提取工艺[J]. 食用菌学报, 2015, 22(3): 69-73. DOI:10.16488/ j.cnki.1005-9873.2015.03.015.

[7] CAO X, LIU R, LIU J, et al. A novel polysaccharide from Lentinus edodes mycelia exhibits potential antitumor activity on laryngeal squamous cancer cell line Hep-2[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 171(6): 1444-1453. DOI:10.1007/s12010-013-0441-6.

[8] 宋力, 王红军, 常梁梁, 等. 香菇中抗氧化成分的提取工艺研究[J]. 食品科技, 2012, 37(2): 243-246. DOI:10.13684/j.cnki. spkj.2012.02.021.

[9] 王谦, 齐悦歌. 以香菇柄为主料固态发酵血芝提取液的抗氧化活性研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(2): 682-685.

[10] MI R L, HOU J G, BEGUM S, et al. Comparison of constituents, antioxidant potency, and acetylcholinesterase inhibition in Lentinus edodes, Sparassis crispa, and Mycoleptodonoides aitchisonii[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22(6): 1747-1751. DOI:10.1007/ s10068-013-0276-5.

[11] 王淑蕾, 梁敬钰, 唐庆九. 香菇嘌呤的研究进展[J]. 菌物学报, 2012, 31(2): 151-158. DOI:10.13346/j.mycosystema.2012.02.001.

[12] 苏倩倩, 陈贵堂, 裴斐, 等. 不同干燥方式对香菇品质及甲醛含量的影响[J]. 食品科学, 2015, 36(17): 33-38. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201517007.

[13] 张小利, 夏春燕, 王慧清, 等. 超微粉碎对香菇多酚组成及抗氧化活性的影响[J]. 食品科学, 2015, 36(11): 42-49. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201511009.

[14] ENMAN J, ULRIKA ROVA A, BERGLUND K A. Quantification of the bioactive compound eritadenine in selected strains of shiitake mushroom (Lentinus edodes)[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2007, 55(4): 1177-1180. DOI:10.1021/jf062559+.

[15] 彭敏, 金德珍. 香菇的药理作用以及临床应用研究进展[J]. 医药前沿, 2012, 2(14): 126-127. DOI:10.3969/j.issn.2095-1752.2012.14.109.

[16] 王北洪, 刘静, 姚真真, 等. 栽培食用菌重金属含量的测定及健康风险评价[J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(2): 490-496.

[17] PEI D, XIE H, SONG H, et al. Bioconcentration factors and potential human health risks of heavy metals in cultivated Lentinus edodes in Chengdu[J]. Journal of Food Protection, 2015, 78(2): 390-395. DOI:10.4315/0362-028X.JFP-14-336.

[18] 徐丽红, 吴应淼, 叶长文, 等. 重金属镉在香菇品种中的积累比较[J]. 食用菌学报, 2006, 13(4): 91-94. DOI:10.3969/j.issn.1005-9873.2006.04.012.

[19] 吴阳. 香菇镉富集规律及其控制方法初步研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2013: 8-10. DOI:10.7666/d.Y2394381.

[20] SCHLECHT M T, SAUMEL I. Wild growing mushrooms for the Edible City? Cadmium and lead content in edible mushrooms harvested within the urban agglomeration of Berlin, Germany[J]. Environmental Pollution, 2015, 204: 298-305. DOI:10.1016/ j.envpol.2015.05.018.

[21] 贾彦. 北京市食用菌重金属含量调查与风险评价[D]. 北京: 中国农业大学, 2007: 18-29. DOI:10.7666/d.y1107782.

[22] 李三暑, 雷锦桂, 陈惠成. 镉、磷、钙在姬松茸细胞内的积累和分布特征及其交互作用[J]. 食用菌学报, 2001, 8(4): 24-27. DOI:10.3969/j.issn.1005-9873.2001.04.006.

[23] 边银丙. 一种抑制香菇对重金属镉富集量的方法: 103570473[P]. 2014-2-12.

[24] 吴学谦. 一种可阻断香菇吸附重金属的矿质培养料: 101417902[P]. 2009-4-29.

[25] 黄翠红, 孙道华, 李清彪, 等. 利用柠檬酸去除污泥中镉、铅的研究[J]. 环境污染与防治, 2005, 27(1): 73-75. DOI:10.3969/ j.issn.1001-3865.2005.01.022.

[26] 单恩莉, 林赛君, 薛亚平, 等. 东海乌参重金属脱除工艺的研究[J]. 食品工业科技, 2013, 34(16): 239-244. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2013.16.032.

[27] 丁仲仲. 坛紫菜中重金属脱除技术研究[D]. 宁波: 宁波大学, 2014: 39-43.

[28] WANG Y, WANG C, CHENG W, et al. Removal of cadmium from contaminated Lentinula edodes, by optimized complexation and coagulation[J]. Food Science & Nutrition, 2016, 5(2): 215-222. DOI:10.1002/fsn3.384.

[29] 闵甜, 王林, 曹珂, 等. 微波-柠檬酸浸出城市污泥中重金属[J]. 应用化工, 2012, 41(12): 2081-2084. DOI:10.16581/j.cnki.issn1671-3206.2012.12.049.

[30] 郭晓方, 卫泽斌, 许田芳, 等. 不同pH值混合螯合剂对土壤重金属淋洗及植物提取的影响[J]. 农业工程学报, 2011(7): 96-100. DOI:10.3969/j.issn.1002-6819.2011.07.016.

[31] SUN L, LIU H Q, WEI G X, et al. Removal of heavy metals from contaminated soils by washing with citric acid and subsequent treatment of soil-washing solutions[J]. Advanced Materials Research, 2014, 937: 646-651. DOI:10.4028/www.scientific.net/AMR.937.646.

[32] 胡群群, 李志安, 黄宏星, 等. 柠檬酸促进土壤镉解吸的机理研究[J]. 生态环境, 2011(8): 1338-1342. DOI:10.3969/ j.issn.1674-5906.2011.08.025.

[33] 王显海, 刘云国, 曾光明, 等. EDTA溶液修复重金属污染土壤的效果及金属的形态变化特征[J]. 环境科学, 2006, 27(5): 1008-1012. DOI:10.3321/j.issn: 0250-3301.2006.05.035.

[34] 许超, 夏北城, 林颖. 柠檬酸对中低污染土壤中重金属的淋洗动力学[J]. 生态环境学报, 2009, 18(2): 507-510. DOI:10.3969/ j.issn.1674-5906.2009.02.022.

Removal of Cadmium from Lentinus edodes Using Citric Acid: Optimization of Processing Conditions Using Response Surface Methodology

HU Jing1, SUN Junshe2, TAN Xiaoyan1, HU Shaofeng1, QIN Zifang1, NING Huijuan1, ZHANG Xiuqing1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Chinese Academy of Agricultural Engineering, Beijing 100125, China)

The removal of the heavy metal cadmium in dried Lentinus edodes using citric acid content was optimized using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The removal efficiency of cadmium was investigated as a function of three independent variables: citric acid concentration, pH and rotation speed. It turned out that the maximum removal rate of cadmium of 57.0% was obtained under the following optimized conditions: citric acid concentration 0.32 mol/L, pH 5.0, and rotation speed 70 r/min. After the treatment, the maximum residual cadmium content was 0.41 mg/kg, lower than the national limit of 0.5 mg/kg. Meanwhile, low losses of polysacccharides and proteins were observed suggesting good retention of nutrients in L. edodes. The proposed method could have a high application potential for reducing residual cadmium in L. edodes.

Lentinus edodes; cadmium; citric acid; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201714028

TS201.6

A

1002-6630（2017）14-0181-06

胡静, 孙君社, 谭晓妍, 等. 响应面法优化柠檬酸去除香菇中镉工艺[J]. 食品科学, 2017, 38(14): 181-186.

10.7506/ spkx1002-6630-201714028. http://www.spkx.net.cn

HU Jing, SUN Junshe, TAN Xiaoyan, et al. Removal of cadmium from Lentinus edodes using citric acid: optimization of processing conditions using response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(14): 181-186. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714028. http://www.spkx.net.cn

2016-12-05

国家自然科学基金面上项目（21576142）；中国农业大学基本科研业务费项目（2017SP001）

胡静（1993—），女，硕士研究生，研究方向为真菌多糖性质及代谢调控。E-mail：hujing9293@126.com

*通信作者：张秀清（1976—），女，副教授，博士，研究方向为次生代谢及调控。E-mail：xiuqingzhang@cau.edu.cn