幽门螺杆菌感染者IL-8-251多态性及胃液相关细胞因子分泌

孙新六

(泰山医学院附属泰山医院中心实验室，山东 泰安 271000)

幽门螺杆菌感染者IL-8-251多态性及胃液相关细胞因子分泌

孙新六

(泰山医学院附属泰山医院中心实验室，山东 泰安 271000)

目的 探讨幽门螺杆菌感染者IL-8-251各基因型与胃液中血管生成相关的细胞因子分泌之间的相关性。方法 摘取正常人和胃癌患者胃黏膜组织以PCR-RFLP技术对IL-8-251进行基因分型；ELISA法检测胃分泌液中IL-8、VEGF和MMP-9细胞因子浓度。结果 HP(-)正常对照组中，AA型：IL-8(14.4±1.2)μmol/l，VEGF(2.31±0.48)μmol/l，MMP-9(20.4±5.3)μmol/l；TT型：IL-8 (8.7±2.6)μmol/l，VEGF(1.28±0.33)μmol/l，MMP-9(8.9±3.5)μmol/l。HP(+)对照组：AA型：IL-8(22.6±5.3)μmol/l，VEGF(3.22±0.62)μmol/l，MMP-9(27.2±6.7)μmol/l；TT型：IL-8(14.2±3.6)μmol/l，VEGF(1.44±0.38)μmol/l，MMP-9(10.6±4.4)μmol/l。HP(-)胃癌组：AA型：IL-8(32.8±6.6)μmol/l， VEGF(3.81±0.72)μmol/l，MMP-9(46.2±8.3)μmol/l；TT型: IL-8(22.3±4.5)μmol/l, VEGF(1.83±0.42)μmol/l, MMP(20.2±4.6)μmol/l。HP(+)胃癌组：AA型：IL-8(38.2±5.6)μmol/l，VEGF(4.62±0.76)μmol/l，MMP-9(62.6±13.2)μmol/l；TT型：IL-8(28.6±3.8)μmol/l，VEGF(2.54±0.45)μmol/l，MMP-9(32.1±6.8)μmol/l。结论 伴随HP感染者IL-8-251 AA型胃液中血管生成相关细胞因子IL-8、VEGF和MMP-9分泌增强，提示IL-8-251 AA型且HP感染者可能更易促使胃癌的发生发展。

幽门螺杆菌；白介素8；单个核苷酸多态性；细胞因子

幽门螺杆菌(helicobacter pylori，HP)是胃癌发生的重要危险因子，但幽门螺杆菌感染者中只有一小部分人发展成胃癌，这与宿主易感性和基因多态性相关[1]。白细胞介素8(IL-8)在胃黏膜炎症反应中起着重要作用，IL-8基因多态性在胃癌的发生中起着重要作用[2]，可能在其癌化过程中激活多种血管形成相关的细胞因子，本研究的目的是阐明IL-8基因多态性对血管形成相关细胞因子的影响，从而探讨胃癌形成的机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象与试剂 均自2010年2月至2015年8月在我院进行胃部内镜筛查和住院病例，受检者4周内均未服用过抗生素药物。其中幽门螺杆菌感染者220例，其中正常者78例，胃癌142例；幽门螺杆菌未感染者264例，其中正常者160例，患癌104例。研究对象本人对此实验均知情，并通过医院医学伦理委员会认可。研究对象均禁食一晚，清晨空胃内镜检查时抽取3 ml胃液，2000 r/min离心10 min,去粘液层获取胃液,以NaOH溶液调pH≈7.0，-20℃冰箱保存待测。同时在非损害的胃黏膜处内窥镜下摘取小块组织，以生理盐水漂洗干净，-20℃冰箱保存。PCR扩增试剂盒与MunI核酸内切酶均购自大连Takara公司。

1.2 幽门螺杆菌感染标准 分别采用快速尿素酶试验(RUT)、免疫组织化学和14C-尿素酶呼吸测试(14C-UBT)三种方法对研究对象进行幽门螺杆菌感染检测，至少有两种检测方法结果显示为阳性才确定该研究对象为幽门螺杆菌感染者。

1.3 胃黏膜组织DNA提取 胃黏膜组织采用蛋白酶K消化、酚/氯仿/异戊醇方法提取组织DNA：胃活检标本剪碎匀浆后加入10 μl蛋白酶K和300 μl消化缓冲液(200 mM Tris- HCl, 25 mM EDTA,300 mM氯化钠,1.2%十二烷基硫酸钠)添加到活检标本, 55 ℃水浴孵育消化12 h。2000 r/min离心10 min，取上清液，加等体积的异丙醇沉淀DNA,离心弃上清，沉淀物加70%的乙醇漂洗。离心后沉淀物轻微干燥,溶解于200 μl TE缓冲液中，调DNA浓度约为500 ng/μl,-20 ℃保存。

1.4 IL-8-251基因分型 IL-8-251多态性采用PCR-限制性内切酶长度多态性检测。PCR引物：上游引物P1：5’-CACTGGAATTAATGTCTTAGTACCA-3’，下游引物P2：5’-AAGCTTGTGTGCTCTGCTGTCTCT-3’。反应体系(25 μl)：模板DNA取100 ng,Taq酶加1U，各引物终浓度为10uM。反应条件：95 ℃预变性3 min；30个循环：95℃变性40 s,58 ℃复性40 s, 72 ℃延伸1 min。最后72 ℃充分延伸10 min。PCR扩增产物在3%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，在凝胶紫外透射仪中观察拍照。

1.5 MunI酶切分析 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，在10μl酶切反应体系中加入1 μl含1单位MunI内切酶液和1 μg PCR纯化产物，37 ℃水浴酶切反应2 h,在3%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，在凝胶紫外透射仪中观察拍照。

1.6 胃液细胞因子检测 采用ELISA商品试剂盒检测胃液中IL-8、MMP-9和VEGF等因子浓度，酶标板孔中分别加入100 μl待测胃液样品和系列稀释后的标准品，同时设好空白和阴性对照，37 ℃水浴孵育1 h,弃液，以PBS液漂洗三次。加针对相应抗原的一抗100 μl，同样水浴孵育和漂洗，再加入HRP酶标的二抗100 μl，水浴1 h，PBS漂洗后，再加入反应底物，37 ℃反应20 min,中止反应，在酶标仪上以450 nm波长测量各孔OD值，以标准品测值做标准曲线，再求出各个待测样品细胞因子的浓度。

1.7 统计分析 实验数据以SPSS18.0分析，以卡方检验对IL-8-251基因期望频率和观察频率做hardy-Weinberg平衡检测，实验组和对照组HP感染率和IL-8-251等位基因频率以χ2检验，并计算出风险率(OR)和95%可信区间(95%CI)。各基因型细胞因子浓度数据进行Kruskal-Wallis检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IL-8基因分型 IL-8基因PCR纯化产物用MunI酶切后，呈现AA、AT和TT三种类型，AA型为500 bp和298 bp两片段，TT型为798 bp一个片段，AT型为798 bp、500 bp和298 bp三个片段(图1)。并经过测序确证IL-8 251位点的碱基变异。

图1 IL-8-251基因内切酶分析

2.2 HP感染及IL-8-251多态性 相对于健康对照组，胃癌组幽门螺杆病感染率高，差异显著(P<0.001)，IL-8-251A/T等位基因比例在胃癌中相对较高，两组差异显著(P<0.05)，显示HP感染和IL-8-251 A基因位点均是胃癌发生的相关风险因子。

表1 HP感染和IL-8-251等位基因在正常组与胃癌组中分布

2.3 胃液细胞因子浓度 在幽门螺杆菌感染组，胃液中MMP-9浓度、IL-8浓度和VEGF浓度看，相对于HP非感染正常对照组增高，经t检验两组差异显著，显示HP感染能增加胃液中MMP-9、IL-8和VEGF分泌。

表2 胃液中细胞因子浓度(μmol/L)

表3 胃液中各基因型细胞因子分泌(μmol/L)

**：每一基因型中，细胞因子浓度在四组中差异显著(P<0.01)。

3 讨 论

幽门螺杆菌是胃癌发生的重要危险因素，幽门螺杆菌感染人胃黏膜,与胃和十二指肠的慢性萎缩性胃炎等疾病密切相关,可导致消化性溃疡和胃癌[3]。幽门螺杆菌感染率虽高,但大多数人保持无症状，幽门螺杆菌感染者中只有一小部分人最终发展成胃癌，机体敏感性可能提高幽门螺杆菌感染后致胃癌的风险。白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)在幽门螺杆菌引发的胃黏膜炎症反应中起着重要的作用。IL-8能增强中性粒细胞趋化性，激活吞噬细胞释放活性氧自由基引起胃黏膜损伤[4]。幽门螺杆菌脂多糖(LPS)和幽门螺杆菌表面蛋白能够激活巨噬细胞和单核细胞，产生炎性和免疫调节细胞因子如TNF-α和IL-1β，它们可引起胃黏膜上皮细胞病损。本实验显示幽门螺杆菌感染者胃液中IL-8、基质金属蛋白酶(MMP)9和血管内皮生长因子(VEGF)浓度相对于非感染者显著增加。这些细胞因子促使胃黏膜血管生成和血管扩张，基质金属蛋白酶(MMP)可降解细胞外基质和内皮基底膜，促使胃肿瘤血管生成，提高癌细胞养分和氧气的供应，促进肿瘤生长和转移[5]。幽门螺杆菌胃感染可诱导慢性活动性胃炎最后可致胃黏膜萎缩和肠化生，增加胃癌风险。IL-8-251等位基因可分为AA、AT和TT三种多态性， IL-8-251 AA基因型与胃癌的血管生成相关，AA型可提高胃癌发生的风险。幽门螺杆菌感染的临床表现与多种因素相关,包括细菌毒力因素,环境因素和遗传因素。本实验显示HP感染和IL-8-251 A基因位点均是胃癌发生的相关风险因子。基因多态性在不同民族呈现不同频率，这可能解释幽门螺杆菌感染致胃癌呈现种族差异性。IL-8-251基因多态性与血管生成相关因子的表达相关，实验显示IL-8-251 A A型可提高胃液中白细胞介素(IL)8，MMP-9和VEGF三种细胞因子水平，IL-8-251 AA型更易发展成胃癌。幽门螺杆菌感染组胃液中MMP-9浓度、IL-8浓度和VEGF浓度,相对于HP非感染正常对照组增高。相对于HP(-)对照组，HP(+)对照组、HP(-)胃癌组和HP(+)胃癌组胃液中MMP-9、VEGF和IL-8细胞因子水平上升，三种细胞因子在IL-8-251 AA型中表达增加。IL-8-251基因的A / T碱基型与三种细胞因子合成相关联。幽门螺杆菌胃感染，胃黏膜处有淋巴细胞和浆细胞渗透，中性粒细胞被白介素8诱导合成活性自由基,如一氧化氮，它们具有分子诱变的潜力，可能导致胃上皮细胞突变[6]。幽门螺杆菌感染可促使辅助性T1细胞(Th1)免疫反应发生，幽门螺杆菌能诱导促炎的Th1细胞因子如TNF-α、干扰素γ分泌，促进胃黏膜萎缩、胃酸过少和肠上皮化生。幽门螺杆菌间接刺激活化细胞毒素，幽门螺杆菌感染促使胃上皮细胞分泌白细胞介素8，诱导中性粒细胞和单核细胞的浸润而致慢性胃炎。IL-8还通过促进iNOS的表达，产生NO及超氧负离子参与炎症反应[7]。幽门螺杆菌可激活NF-KB、AP-1转录因子，促进胃黏膜炎症反应。

研究发现IL-8-251AA型感染HP毒株(cagA+)更易诱发胃炎和胃癌，cagA可以激活Ras→ERK信号通路，cagA+幽门螺杆菌可产生更强烈的炎症反应和胃黏膜上皮细胞DNA损伤[8]。胃癌发生机制中，IL-8有三种作用，其一促进血管内皮细胞生长，使血管形成；其二促进肿瘤细胞生长和扩散；其三参与胃黏膜炎症反应，并释放多种生长因子和各种活化酶。三种机制加速胃癌变。IL-8的受体CXCR和CXCR2过表达与胃癌相关，IL-8与其结合可促进表皮生长因子受体(EGFR)磷酸化而促进胃癌变。鉴于IL-8和幽门螺杆菌在致胃癌中作用，可以考虑使用靶向IL-8的受体CXCR1、CXCR2的抑制剂和HP杀菌药物预防胃癌。

实验表明，幽门螺杆菌感染和IL-8-251多态性可影响胃液中血管形成相关细胞因子分泌。通过监测幽门螺杆菌感染和IL-8-251基因分型，可以筛选出胃癌易发人群，进行早期干预措施进行胃癌预防。

[1] Lee YY, Derakhshan MH.Environmental and lifestyle risk factors of gastric cancer[J].Arch Iran Med，2013，16:358-365.

[2] Wroblewski LE,Peek Jr RM, Wilson KT.Helicobacter pylori and gastric cancer: factors that modulate disease risk[J].Clin Microbiol Rev，2010，23:71.

[3] Handa O,Naito Y,Yoshikawa T. Redox biology and gastric carcinogenesis:the role of Helicobacter pylori[J]. Redox Rep,2011,16:1-7.

[4] Kuai WX,Wang Q,Yang XZ,et al.Interleukin-8 associates with adhesion, migration, invasion and chemosensitivity of human gastric cancer cells[J]. World J Gastroenterol,2012,18:979-985.

[5] Lee KE,Khoi PN,Xia Y.Helicobacter pylori and interleukin-8 in gastric cancer[J]. World J Gastroenterol,2013,19(45):8192-202.

[6] Park KJ,Lee CH,Kim A.Death,receptors 4 and 5 activate Nox1 NADPH oxidase through riboflavin kinase to induce reactive oxygen species-mediated apoptotic cell death[J]. J Biol Chem,2012,287:3313-3325.

[7] Lamb A,Chen LF.The many roads traveled by Helicobacter pylori to NF-KB activation[J]. Gut Microbes, 2010,1:109-113.

[8] Boonyanugomol W,Chomvarin C,Hahnvajanawong,C.Helicobacter pylori cag pathoge n icity island (cagPAI) involved in bacterial internalization and IL-8 induced responses via NOD1- and MyD88-dependent mechanisms in human biliary epithelial cells[J]. PLoS One,2013,8(10):203-207.

IL-8-251 polymorphism in patients with Helicobacter pylori infection and related cytokine secretion in gastric juice

SUN Xin-liu

(Central Laboratory of Taian Central Hospital, Taian 271000,China)

Objective：To investigate the correlation between IL-8-251 genotypes and the secretion of cytokines related to blood vessels in gastric juice. Methods：The gastric mucosal tissue was obtained with endoscopy and the genotype of IL-8-251 and analyzed with PCR-RFLP;also the concentration of IL-8, VEGF and MMP-9 in gastric juice were detected with ELISA. Results:HP(-) control group:AA type:IL-8 (14.4±1.2)μmol/l, VEGF(2.31±0.48)μmol/l, MMP-9 (20.4±5.3)μmol/l; TT type: IL-8 (8.7±2.6)μmol/l, VEGF (1.28±0.33)μmol/l, MMP-9 (8.9±3.5) μmol/l；HP(+) control group:AA type:IL-8 (22.6±5.3)μmol/l, VEGF(3.22±0.62)μmol/l, MMP-9 (46.2±8.3)μmol/l;TT type:IL-8 (14.2±3.6)μmol/l, VEGF (26.4±3.8)μmol/l, MMP-9 (42.6±8.3)μmol/l. HP(-)gastric cancer group:type AA:IL-8 (32.8±6.6)μmol/l, VEGF (3.81±0.72)μmol/l MMP-9(46.2±8.3 )μmol/l; TT type:IL-8 (22.3±4.5)μmol/l, VEGF (1.83±0.42) μmol/l， MMP (20.2±4.6) μmol/l. HP (+) group of gastric cancer:AA type:IL-8 (38.2±5..6) μmol/l, VEGF (4.62±0.76)μmol/l, MMP-9 (62.6±13.2)μmol/l;TT type:IL-8 (28.6±3.8) μmol/l, VEGF(2.54±0.45)μmol/l, MMP-9 (32.1±6.8)μmol/l. Conclusion: The cytokines related to blood vessels(IL-8、VEGF and MMP-9)in gastric juice secretion of IL-8-251 type AA group with HP infection increases, which suggest that AA type with HP infection may occur more likely to induce gastric cancer.

helicobacter pylori;IL-8;single nucleotide polymorphism;cytokines

孙新六(1970—)，男，安徽安庆人，硕士，主要从事临床分子生物学研究工作。

R446.1

A

1004-7115(2017)07-0737-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.07.006

2017-04-02)