高效液相色谱-串联质谱法对水环境中12种抗生素的检测

徐晖,吴明红,徐刚

(上海大学环境与化学工程学院,上海 200444)

高效液相色谱-串联质谱法对水环境中12种抗生素的检测

徐晖,吴明红,徐刚

(上海大学环境与化学工程学院,上海 200444)

利用固相萃取(solid phase extraction,SPE)及液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)联用技术,建立了水体中痕量磺胺类、β-内酰胺类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类等12种抗生素的定量分析方法.水样中的12种抗生素通过亲水疏水平衡(hydrophile lipophilic balance,HLB)小柱的萃取富集后,以乙腈为有机相、0.2%甲酸和醋酸铵混合水溶液为水相,采用LC-MS/MS进行定量分析.抗生素采用电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)源多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式,以13C3-caffeine作为内标物进行定量检测.抗生素在河水中的方法定量限为0.004 83～4.805 00 ng/L,回收率为71%∼90%.该方法被应用于分析南陈河(上海)中抗生素的含量,平均质量浓度为2.04∼254.46 ng/L.

抗生素;液相色谱-串联质谱;样品前处理

抗生素(antibiotics)是一种广泛使用的药物,抗生素大量使用后进入环境中会造成严重的生态环境问题,这已经引起了人们的广泛关注.由于抗生素是极性化合物,具有亲水、弱挥发性等特征,故自然水体是抗生素主要的存在介质[1].随着抗生素研究的逐步加深,已经从表面水体[2-4]、地下水[5]、饮用水[6]、城市污水[7-8]等多种环境水体中检出抗生素的存在.

目前,常用的抗生素检测方法主要有酶联免疫测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法[9-11]及液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法等[7,12-13].近年来,由于LC-MS/MS技术具有高灵敏度、低检测限的特性而被广泛地用于抗生素药物等极性、非挥发性污染物的分析[14].本研究利用固相萃取(solid phase extraction,SPE)技术,结合LC-MS/MS分析技术,使用内标定量的方法建立检测河流水体中痕量的磺胺类(sulfonamides)、β-内酰胺类(β-lactams)、四环素类(tetracyclines)、喹诺酮类(fluoroquinolones)、大环内酯类(macrolides)5大类12种抗生素残留的方法,并初步采样检测出河水中的抗生素残留,质量浓度范围为2.04∼254.46 ng/L.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪,配自动进样器;Agilent 6460三重四极杆串联质谱仪,配有电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)源;12孔固相萃取装置(安谱公司);亲水疏水平衡(hydrophile lipophilic,HLB)固相萃取小柱(500 mg/6 mL,美国Waters公司);中速定性滤纸(国药公司);0.7µm滤膜(英国Maidstone公司);甲醇、乙腈、醋酸铵均为色谱纯(德国Merck公司);甲酸为色谱纯(安谱公司);乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)为分析纯(国药公司);超纯水(实验室自制).

磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole,SMX)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine,SMZ)、头孢氨卡(cefalexin,CFX)、阿莫西林(amoxicillin,AMOX)、四环素(tetracyclines,TC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)、氧氟沙星(ofloxacin,OFL)、红霉素(erythromycin,ERY)、罗红霉素(roxithromycin,ROX)、螺旋霉素(spiramycin,SPI)(德国Ehrenstofer GmbH公司);内标13C3-caffeine(美国Cerilliant公司).

标准溶液的配制：分别称取适量的12种抗生素标准样品(精确到0.01 mg),溶解于10 mL甲醇,于4◦C状态下保存.

内标物储备液的制备：将内标溶液用甲醇溶解于100 mL容量瓶中,用甲醇定容配成10 mg/L的储备液,于4◦C状态下保存.

1.2 样品采集

本工作于上海市宝山区南陈河采集河水500 mL,其中水样采集瓶为超声清洗后的棕色瓶,采集时先用河水润洗两次.水样采集后经过中速定性滤纸过滤,再经0.7µm滤膜过滤,之后于500 mL样品滤液中分别加入0.1 g EDTA-2Na,并且用硫酸调节pH值至3.0左右,分别加入100 ng内标物质,采集完的样品于3 d内处理完毕.

1.3 样品前处理

HLB小柱经活化(分别用6 mL甲醇、超纯水、100 mL加0.1 g的EDTA-2Na水溶液(pH值为3.0∼3.5)淋洗Oasis HLB萃取小柱)后,500 mL水样,以10 mL/min的流速通过小柱,待所有样品过柱后,用10 mL(pH值为3.0∼3.5)超纯水淋洗小柱,真空抽气干燥1 h,使用6 mL甲醇洗脱小柱,洗脱液收集于10 mL氮吹管,然后氮吹洗脱液至0.2 mL,用甲醇定容至1 mL.最终样品的富集倍数为500倍.

1.4 色谱条件

安捷伦C18色谱柱(3.0 mm×100 mm,2.7µm);柱温：40◦C;进样量：5µL;流速： 0.4 mL/min;流动相A：乙腈;流动相B：含0.2%甲酸和5 mmol/L醋酸铵溶液;梯度洗脱顺序(流动相A)：0∼5 min,0∼13%;5∼10 min,13%∼20%;10∼32 min,20%∼90%.

1.5 质谱条件

采用ESI源,分析物在正离子扫描下以多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式分析.毛细管电压：4.5 kV;射频透镜电压：0.5 V;离子源温度：90◦C;脱溶剂温度：350◦C;脱溶剂气流速：500 L/h;锥孔反吹气流速：30 L/h;检测模式：MRM.12种抗生素和1种内标物的检测参数如表1所示.

表1 12种抗生素和1种内标物的LC-MS/MS主要参数Table 1 Instrumental analysis data about 12 antibiotics and 1 internal standard

2 结果与讨论

2.1 液相色谱-串联质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件

本实验比较了乙腈和甲醇作为LC-MS/MS流动相的有机相.结果表明使用乙腈作为流动相时,图谱基线较低,出峰峰形较好;而甲醇作为流动相时,基线较高,部分出峰有峰形拖尾的现象.实验还比较了0.1%,0.2%,0.3%的甲酸以及纯水作为水相流动相对抗生素类药物出峰的影响,结果发现随着甲酸、各抗生素的母离子丰度提高,峰形变差;总体比较发现,甲酸浓度为0.2%时,离子出峰峰形与丰度的综合效果达到最佳.同时,Zhou等[8]在流动相中加入醋酸铵改善离子出峰峰形,减少峰形拖尾的现象,故实验最终选择乙腈和0.2%甲酸及5 mmol/L醋酸铵的混合溶液作为水相流动相.

2.1.2 质谱条件

根据所选取抗生素的分子结构及其物理化学性质,本实验选择了ESI源作为离子源.实验在正离子模式下,使用单离子检测扫描(single ion monitor,SIM)模式对各抗生素的母离子进行扫描,优化仪器参数,找到合适的裂解电压,使母离子丰度达到最佳;然后,根据得到的准分子离子峰以适当的碰撞能量对准分子离子进行碰撞,对所得的碎片离子进行子离子扫描,选择其中响应值最强的子离子作为定量离子,选择响应值相对较强且作为特征离子峰的离子为定性离子;最后,选择MRM扫描模式对子离子进行碰撞能量的优化,得到定量离子和定性离子的最佳碰撞电压.优化后的仪器参数以及各抗生素的母离子与子离子如表1所示.由于本实验检测的12种抗生素在正离子模式下均可成功电离,故不需要采用负电子模式,可于正电子模式下一次性进样得到相关检测数据.

2.2 固相萃取条件的优化

在预处理过程中,为了达到最佳萃取效果,使水样中抗生素的回收率达到最高,本工作进一步优化了SPE技术的相关条件.对超纯水中在pH值为2.0,3.0,4.0,7.0这4种条件下的各类抗生素的回收率进行了对比实验(见表2).表2中,pH值为3.0的条件下抗生素的回收率达到最佳,故实验在采集水样中添加硫酸,调节pH值为3. 0;同时调节SPE小柱第三次活化液以及萃取过程中清洗液的pH值为3.0,从而保证整个萃取过程中小柱内部的pH值保持稳定.另一方面,EDTA-2Na溶液的加入阻止了大环内酯类抗生素与样品中金属离子可能产生的螯合作用,大幅提高萃取效率,同时对磺胺类等其余抗生素的萃取没有不利影响.

表2 12种抗生素和1种内标物在不同pH条件下的回收率Table 2 Recovery rates of 12 antibiotics and 1 internal standard in different pH conditions%

2.3 线性范围和检出限

由于水环境中存在的高质量浓度溶解有机质可能会导致检测过程中LC-MS/MS的信号增强或减弱,从而影响实际样品定量结果的准确性.为了保证检测结果的准确性与可靠性,本实验加入100 ng内标物13C3-caffeine,对实际样品内标物的质谱响应面积与标准样品中内标物面积的比值进行计算,确定实际样品的回收率.内标物13C3-caffeine在近些年的实验中被广泛用于检测抗生素类物质[7-8].

本实验配置0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0,500.0,1 000.0µg/L的系列混合工作标准溶液(含12种抗生素以及1种内标物),绘制标准工作曲线.12种抗生素和1种内标物的线性关系及在实际样品中的方法定量下限(信噪比S/N>10)如表3所示.

表3 12种抗生素和1种内标物的保留时间、方法定量下限、线性范围与R2Table 3 Retention time,limit of quantification,line range and R2of 12 antibiotics and 1 internal standard

2.4 加标回收率实验

为了验证方法的准确性以及稳定性,本实验选取6个超纯水样品和6个实际河水样品,分别加入抗生素标样与内标物质(每种化合物取100 ng),计算抗生素在不同水体中的回收率. 100 ng各种抗生素与13C3-caffeine内标物于超纯水样品中的加标质谱图如图1∼4所示,每6个样品中加入过程空白样品以保证预处理过程的准确性,所有加标样品均釆用相同方法进行预实验和处理分析,各抗生素在超纯水和河水中的回收率与相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)如表4所示.

图1 超纯水中磺胺类抗生素与13C-caffeine加标回收率MRM质谱图Fig.1 MRM chromatogram of sulfonamides antibiotics and13C-caffeine recovery in pure water samples

图2 超纯水中β-内酰胺类与喹诺酮类抗生素加标回收率MRM质谱图Fig.2 MRM chromatogram of β-lactams and fluoroquinolones antibiotics recovery in pure water samples

图3 超纯水中四环素类与螺旋霉素抗生素加标回收率MRM质谱图Fig.3 MRM chromatogram of tetracyclines and spiramycin antibiotics recovery in pure water samples

图4 超纯水中红霉素与罗红霉素抗生素加标回收率MRM质谱图Fig.4 MRM chromatogram of erythromycin and roxithromycin antibiotics recovery in pure water samples

表4 12种抗生素的回收率与相对标准偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations of 12 antibiotics%

2.5 实际样品检测

本工作在上海地区的南陈河进行了采样与实际样品质量浓度检测,其中有10种物质成功检出(见表5),没检测到的物质为四环素与螺旋霉素.在检测出的10种物质中,平均浓度最高为氧氟沙星(254.46 ng/L);质量浓度最低为磺胺二甲基嘧啶(2.04 ng/L).

表5 实际样品检测结果Table 5 Determination results of real samplesng/L

3 结束语

本工作利用SPE技术进行前处理,并结合LC-MS/MS建立了一种对水体中磺胺类、β-内酰胺类物质、四环素类、喹诺酮类、大环内酯等12种抗生素的定量分析方法.通过SPE技术以及对LC-MS/MS相关参数的优化,确定了本方法检测的准确性与可靠性,且本方法所达到的检出限可以满足大部分检测要求.此外,本工作对实际河水样品进行了检测,结果显示大部分抗生素都被成功检出,说明了有进一步研究抗生素在环境水体中的污染情况的必要性.

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Determination of 12 antibiotics in aqueous environment by high performance LC-MS/MS

XU Hui,WU Minghong,XU Gang
(School of Environmental and Chemical Engineering,Shanghai University,Shanghai 200444,China)

This paper proposes a quantitative method for trace detection of 12 antibiotics including sulfonamides,β-lactams,fluoroquinolones,tetracyclines,macrolides in waters using solid phase extraction(SPE)coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).After enriching thought hydrophile lipophilic balance(HLB)cartridges, 12 antibiotics are detected by LC-MS/MS with the organic phase of acetonitrile and aqueous phase of ammonium acetate and 0.2%formic acid.The antibiotics are quantified with multiple reaction monitoring(MRM)mode by internal standard of13C3-caffeine.Quantification limits for antibiotics are from 0.004 83 to 4.805 00 ng/L in river water and the recoveries ranged from 71%to 90%.The method is applied to detect antibiotics in Nanchen River,Shanghai.Mean concentrations of antibiotics are from 2.04 to 254.46 ng/L.

antibiotics;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS); sample pretreatment

O 657.63

A

1007-2861(2017)03-0483-08

10.12066/j.issn.1007-2861.1655

2015-03-30

国家自然科学基金资助项目(41430644,11175112,41373098,41273141,41473090)

吴明红(1968—),女,教授,博士生导师,博士,研究方向为污染控制与环境毒理学. E-mail：mhwu@staff.shu.edu.cn