核桃内种皮提取物对小鼠脑损伤的改善作用

张泽生，王霄然，王田心，*，秦程广，高山，王春龙

（1.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，食品工程与生物技术学院，天津科技大学，天津300457；2.天津科技大学新农村发展研究院，天津300457）

核桃内种皮提取物对小鼠脑损伤的改善作用

张泽生1，2，王霄然1，2，王田心1，2，*，秦程广1，高山1，王春龙1

（1.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，食品工程与生物技术学院，天津科技大学，天津300457；2.天津科技大学新农村发展研究院，天津300457）

研究核桃内种皮多酚提取物对D-半乳糖致衰小鼠脑组织氧化损伤程度的调节。选取ICR雄性小鼠60只，随机分为5组，每组12只，对模型对照组和剂量组小鼠采取颈部皮下注射D-半乳糖[120 mg/（kg·bw·d）]制造衰老模型，低、中、高剂量组分别灌胃200、400、800 mg/（kg·bw·d）的核桃内种皮多酚提取物，模型对照组灌胃等量的双蒸水。给药7周后，通过旷场试验、紧绳实验和平衡木实验检测每组小鼠间的行为学差异。8周后，取脑组织，测定脑组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力和总抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）的含量。结果表明，与模型对照组相比，核桃内种皮多酚提取物可显著提高小鼠的运动和探索能力，增强小鼠的兴奋性和对环境的适应性。同时，脑组织中SOD、GSH-Px活力和T-AOC含量较模型组有显著升高。这表明核桃内种皮多酚提取物可减轻D-半乳糖导致的行为迟钝，并能减轻小鼠脑部的氧化损伤。

核桃内种皮；多酚；衰老；脑；氧化损伤

目前，自由基导致衰老的理论在相关研究中占有重要地位，已经有大量的实验证实其致衰作用，D-半乳糖致衰模型也得到了广泛应用和支持[1]。脑组织中富含高浓度不饱和脂肪酸，且氧化代谢非常旺盛，是自由基最易侵袭的靶器官，因此也是最容易发生衰老的组织之一[2]。本试验以核桃产业加工过程中产生的废弃物——核桃内种皮为原料，从中提取活性物质，对其进行活性探究。通过旷场试验、紧绳实验和平衡木实验等行为学指标，以及脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力和总抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）的含量，研究核桃内种皮多酚提取物对衰老小鼠脑组织的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 核桃内种皮中多酚的提取

经碱处理后的核桃内种皮废弃物来自于河北养元饮品有限公司，脱蛋白脱脂后干燥，采用酸性醇溶液加热提取、浓缩、冷冻干燥得核桃内种皮多酚粗提物（纯度为12.55%）。用双蒸水复溶内种皮多酚提取物干粉，配制成适宜浓度的溶液，4℃保存待用。

1.1.2 主要试剂

D-半乳糖：北京索莱宝生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（TAOC）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、考马斯亮蓝蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器

MODULYOD-230冷冻干燥机：Thermo Fisher科技公司；TDL-5-A低速离心机：上海安亭科学仪器厂；JD1000-2电子天平：龙腾电子有限公司；BS224S分析天平：赛多利斯贸易有限公司；Z5高速离心机：SIGMA有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计：岛津检测技术有限公司；QL-901微型漩涡混合器：其林贝尔仪器制造有限公司；HH.SY11电热恒温水浴锅：中环实验电炉有限公司。

1.1.4 实验动物

SPF级6周龄雄性ICR小鼠60只，体重（22±2）g，由中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）提供，合格证号为SCXK（津）2009-0002。饲养于天津科技大学清洁级动物实验房（环境温度为：20℃～22℃、环境设施合格证号：SCXK（京）2012-0001）。

1.2 方法

1.2.1动物分组及给药方式

小鼠适应喂养一周后，按体重呈S型随机分为5组：正常对照组（NC）、D-半乳糖模型对照组（DC）、内种皮多酚提取物低（WPL）、中（WPM）、高（WPH）剂量组，每组12只。

每日同一时间采用颈部皮下注射法对DC组和剂量组小鼠注射D-半乳糖灭菌生理盐水溶液进行衰老模型制造，同时采用不同剂量的内种皮多酚提取物对剂量组小鼠进行灌胃治疗，具体给药方式如下，每日一次，连续8周。

正常对照组（NC）：皮下注射生理盐水+双蒸水灌胃

D-半乳糖模型对照组（DC）：皮下注射D-gal（120 mg/kg）+双蒸水灌胃

低剂量组（WPL）：皮下注射D-gal（120 mg/kg）+内种皮多酚提取物（200 mg/kg）灌胃

中剂量组（WPM）：皮下注射D-gal（120 mg/kg）+内种皮多酚提取物（400 mg/kg）灌胃

高剂量组（WPH）：皮下注射D-gal（120 mg/kg）+内种皮多酚提取物（800 mg/kg）灌胃

1.2.2 行为学试验

1.2.2.1 旷场试验

旷场试验用于测定小鼠的自发探索能力和焦虑性。按照文献[3-4]设计一个旷场实验设备，采用一开口纸箱（内部尺寸为81 cm×81 cm），箱壁直立，高30 cm，底部涂黑，将底部划分成16个等大方格，并标出与方格等大的中间区域。将小鼠面壁随机放入4个边角中的一个方格内，3min内让其自由探索，记录3min内小鼠的跨越方格总数、跨越中间区域格数、理毛次数、站立次数以及排便颗粒数。

1.2.2.2.紧绳实验

取一根长100 cm，直径为2 mm细绳，每隔5 cm标记为一格。将绳子绷紧固定于一圆形水池上，并使绳子中点位于圆形水池圆心处，绳子中心距离水面30 cm，水池中水深10 cm，保持水温25℃。先将小鼠提尾浸入圆形水池中5 s，后将小鼠提尾至于绳子上方，缓慢降低至其前爪牢固抓住绳子，放手并计时。以60 s为界记录其掉入水中前的悬挂时间（最大60 s）和跨越格数，每只小鼠连续测试3次，取平均值[5]。

1.2.2.3 平衡木实验

取一根长100 cm，直径10 mm的矩形杆，每隔5 cm标记为一格。将杆水平放置于一圆形水池上，并使杆中点位于圆形水池圆心处，两杆距离水面30 cm，水池中水深10 cm，保持水温25℃。释放方法同紧绳实验，记录60 s内小鼠在杆上的平衡时间和跨越格数，如小鼠逃至第二平台则平衡时间视为60 s。每只小鼠连续测试3次，取平均值。

1.2.3 脑组织抗氧化指标的测定

给药8周后，小鼠于末次给药后禁食12 h，于处死前称重并记录。小鼠眼球取血、颈椎脱臼处死，快速分离脑组织，准确称取 0.1 g，按重量（g）：体积（mL）=1∶9的比例加生理盐水，冰浴条件下机械匀浆，5 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用生理盐水稀释至适当倍数，于-80℃保存。按说明书方法测定SOD、CAT、GSHPx活力，T-AOC和MDA含量。

1.3 统计方法

所有数据均采用SPSS17.0分析软件处理，以Mean±SD表示，组间采用t检验，其中P＜0.05具有显著性差异，P＜0.01具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 旷场试验

旷场试验相关数据如图1所示。

图1 旷场试验（M±SD，n=10）Fig.1 Open-field test（M±SD，n=10）

平均跨越格数可以直接体现小鼠的兴奋性和运动的灵敏性。从图1（A）可以看出：模型组小鼠的平均穿越格数较正常组小鼠有极显著的减少（P＜0.01），表明模型组小鼠的兴奋性和灵敏性明显降低。与模型对照组相比，核桃内种皮多酚提取物剂量组平均跨越格数有所增加，其中高剂量组具有显著性差异（P＜0.05），表明核桃内种皮多酚提取物具有提高衰老小鼠兴奋性和灵敏性的作用。

平均跨越中间格数能够反映小鼠的认知和探索能力。正常情况下动物会避开空旷的区域，在中央格的停留时间短，沿周边运动，对新环境认知能力差的动物，则在中间停留时间较长[6]。从图1（B）可以看出：模型小鼠较正常小鼠的跨越中间区域次数极显著增加（P＜0.01），表明小鼠的认知和探索能力有一定降低。与模型对照组相比，核桃内种皮多酚提取物剂量组平均跨越中间格数有所减少，其中高剂量组具有极显著性差异（P＜0.01），表明核桃内种皮多酚提取物可以提高D-半乳糖致衰老小鼠在陌生环境中的空间认知和探索能力。

平均理毛次数能够反映小鼠对新环境的满意程度。动物的理毛行为出现在比较舒适的环境中，是在新异环境中的休闲行为，说明小鼠在陌生的环境较为适应。如图1（C）所示：与正常对照组相比，模型组小鼠理毛次数极显著性下降（P＜0.01），表明小鼠对新环境的满意程度下降。与模型对照组相比，核桃内种皮多酚提取物剂量组小鼠理毛次数增多，其中核桃内种皮多酚提取物高剂量组具有显著性差异（P＜0.05），说明表明核桃内种皮多酚提取物有助于稳定D-半乳糖致衰老小鼠的情绪。

平均站立次数能够反映小鼠在陌生环境中的兴奋性和对新异环境的探究性。如图1（D）所示：与正常组小鼠相比，模型组小鼠站立次数极显著性下降（P＜0.01），与模型对照组相比，兴奋性有所下降。核桃内种皮多酚提取物剂量组站立次数有增多趋势，其中高剂量组有极显著性差异（P＜0.01），表明核桃内种皮多酚提取物有助于提高小鼠在陌生环境中的兴奋性和对新异环境的探究性。

排便粒数能够反映小鼠在陌生环境中紧张反射情况，排便数越多表明小鼠在陌生环境中越紧张。如图1（E）所示：由于个体差异较大，实验结果误差较大，与空白对照组相比，模型小鼠排便粒数有增多的迹象。与模型对照组相比，核桃内种皮多酚提取剂量组排便数有降低的趋势，但均不具有显著性。

通过这些项目的考察，可以充分的探究小鼠探索性、兴奋性、运动性等一系列运动的水平，从而考核桃内种皮多酚提取对D-半乳糖致衰老小鼠的影响。实验结果证明，核桃内种皮多酚提取可以增强小鼠的探索性、运动性、兴奋性活动，提高对新环境反应灵敏性和适应能力，同时能够促进探索运动与自发活动能力。可以推断核桃内种皮多酚提取可对实验动物的神经行为产生影响，提高其心理运动的稳定性以及敏捷度，来对大脑的思维活动产生积极影响。

2.2 紧绳实验

紧绳实验相关数据如图2所示。

图2 紧绳实验（M±SD，n=10）Fig.2Tightrope test（M±SD，n=10）

紧绳实验中的平均跨越格数和悬挂时间能够反应小鼠的运动协调性和耐力。从图2（A）、（B）可以看出，与正常对照组相比，模型对照组这两项指标都有显著降低（平均跨越格数：P＜0.01，悬挂时间：P＜0.05），说明模型对照组小鼠的运动协调性和耐力受到了一定损害。与模型对照组相比，内种皮多酚提取物剂量组能够增加平均跨越格数并延长悬挂时间，其中，中、高剂量的内种皮多酚提取物可以极显著增加小鼠的平均跨越格数（P＜0.01），高剂量的内种皮多酚提取物可以显著延长小鼠的悬挂时间（P＜0.05）。由于紧绳实验需要运动协同性、较强的肌力和维持平衡的能力，而模型对照组小鼠的两项指标均显著低于空白对照组小鼠，说明模型对照组小鼠的耐力和运动协调性受到损害，内种皮多酚提取物可以缓解该症状，提高小鼠的运动能力。

2.3 平衡木实验

平衡木实验相关数据如图3所示。

平衡木实验中的平均跨越格数和悬挂时间能够反应小鼠的运动协调性和平衡能力。从图3（A）、（B）可以看出，与正常对照组相比，模型对照组的平均跨越格数极显著减少（P＜0.01），说明模型对照组小鼠的运动协调性受到了一定损害。与模型对照组相比，内种皮多酚提取物剂量组能够增加平均跨越格数并延长悬挂时。其中，中、高剂量的内种皮多酚提取物可以极显著增加小鼠的平均跨越格数（P＜0.01）。在判断平衡力实验中，除了模型组和低中剂量组有个别落水，其余均在杆60 s，可能高剂量可以提高衰老小鼠的平衡能力，但数据不具有显著性。由于平衡木实验需要运动协同性、胆量和维持平衡的能力，而模型对照组小鼠的前项指标显著低于空白对照组小鼠，说明模型对照组小鼠的运动协调性受到损害，内种皮多酚提取物可以缓解该症状，提高小鼠的运动能力。

2.4 脑组织抗氧化指标

脑组织抗氧化指标相关数据如表1所示。

由表1可知，模型组小鼠与正常对照组相比，SOD、GSH-Px酶活力及T-AOC含量均有极显著的降低（P＜0.01），MDA含量略有升高、CAT酶活力略有降低，但都不具有显著性。各剂量组与模型组相比，SOD、T-AOC、GSH-Px活力均有不同程度的提高，其中，中、高剂量组SOD活力极显著升高（P＜0.01）；中剂量组（P＜0.05）和高剂量（P＜0.01）组 T-AOC 活力显著提高；低剂量组（P＜0.05）和中、高剂量（P＜0.01）组 GSH-Px活力显著提高。与模型组相比，各剂量组MDA含量均有所降低，其中以中剂量组最为明显，但不具有显著性；高剂量组CAT酶活力有一定程度的增加，但不具有显著性。以上实验结果表明，核桃内种皮多酚提取物可在一定程度上抑制脑组织氧化损伤，起到延缓衰老的作用，中、高剂量组效果较明显。

图3 平衡木实验（M±SD，n=10）Fig.3 Balancing beam test（M±SD，n=10）

表1 内种皮多酚提取物对D-半乳糖致衰小鼠脑抗氧化指标的影响（M±SD，n=10）Table 1 Effect of walnut pellicle phenolic extracts on brain antioxidant indexes of mice induced by D-galactose（M±SD，n=10）

3 讨论

由行为学实验结果可以看出，核桃内种皮多酚提取物能够明显提升小鼠的运动和认知能力，增强小鼠的兴奋性和对环境的适应性。

由脑组织的生化指标可以看出，核桃内种皮多酚提取物通过提高脑组织中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化氢酶活力和总抗氧化能力，延缓了D-半乳糖致衰小鼠的衰老进程。

综上所述，核桃内种皮多酚提取物具有提高小鼠运动能力，增强小鼠兴奋性、适应性以及抗衰老作用，有一定的脑损伤保护作用，其作用机制可能与清除体内自由基和增强体内抗氧化酶活力有关。本实验可为深入探讨其抗衰老机理提供实验依据，同时也为进一步开发和利用核桃内种皮废弃物提供理论基础。

[1]Harman D.Aging,a theory based on free radical and radiation chemistry[J].Journal of Gerontology,1956,11(3):298-300

[2] Afanas’Ev I B.Free Radical Mechanisms of Aging Processes Under Physiological Conditions[J].Biogerontology,2005,6(4):283-290

[3] King D L,Arendash G W,Crawford F,et al.Progressive and genderdependent cognitive impairment in the APPsw transgenic mouse model for Alzheimer’s disease[J].Behavioural Brain Research,1999,103(2):145-162

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Protective Effect of Walnut Pellicle Extracts on Cerebral Injury in Mice

ZHANG Ze-sheng1，2，WANG Xiao-ran1，2，WANG Tian-xin1，2，*，QIN Cheng-guang1，GAO Shan1，WANG Chun-long1
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Institute for New Rural Development，Tianjin 300457，China）

To observe the effects of phenolic extracts from walnut（Juglans regia L.）kernel pellicle（EWP）byproduct on cerebral injury aging mice induced by D-galactose.Male ICR mice（n=60）were randomly divided into five groups of 12 each.Hypodermic injection of D-gal at the dose of 120 mg/（kg·bw·d），low，middle and high groups gived EWP by 200，400，800 mg/（kg·bw·d）respectively，while the control group gavage equivalent normal saline.After 7 weeks，the behavior changes were investigated by open-field test，tightrope test and balancing beam test between dosage groups and normal controls.After 8 weeks，the contents of malonialdehyde（MDA），the activities of superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT），glutathione peroxidase （GSH-Px）and total antioxidant capacity（T-AOC）in brain were observed.The result showed that EWP could significantly improve the mice's ability to exercise and explore，enhance the excitability and the adaptability to the environment.At the same time，it significantly increased activities of the antioxidant enzymes by enhanced activities of SOD，GSH-Px，T-AOC as compared to model group.This indicated that EWP could reduce the action retardation induced by D-galactose，and could reduce the oxidative damage in the brain of mice.

walnut kernel pellicle；phenolic compounds；ageing；brain；oxidative damage

2016-09-01

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.042

天津科技大学新农村发展研究院开放基金资助项目（XNC201511）；教育部科技发展中心“蓝火计划”产学研联合创新项目衡水专项2014年度项目(2014-LHJH-HSZX-017）

张泽生（1956—），男（汉），教授，博士，研究方向：天然产物活性成分。

*通信作者：王田心（1985—），男（汉），讲师，博士，研究方向：天然产物活性成分。