宁夏贺兰山东麓酿酒酵母分离筛选及菌株鉴定

王志恒，刘雅琴，冯翠娥，李仁杰，陈启鹏

（北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏葡萄与葡萄酒技术创新中心，国家民委发酵酿造工程生物技术重点实验室，宁夏银川750021）

宁夏贺兰山东麓酿酒酵母分离筛选及菌株鉴定

王志恒，刘雅琴*，冯翠娥，李仁杰，陈启鹏

（北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏葡萄与葡萄酒技术创新中心，国家民委发酵酿造工程生物技术重点实验室，宁夏银川750021）

为进一步探究宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄酵母菌的多样性，更好开发利用葡萄产区酵母菌资源。从宁夏贺兰山东麓的西夏王陵、红寺堡、玉泉营、青铜峡、张裕十五世酒庄地区的葡萄园土壤、葡萄浆果表皮以及葡萄自然发酵过程中进行酵母菌的分离筛选，对得到的122株酵母菌株运用WL营养琼脂培养基进行初步分类，同时结合26S rDNA D1/D2区序列分析。共鉴定出克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大隐球酵母（Cryptococcus magnus）共 5种酵母菌。进而初步确定宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄产区酵母菌的主要种类，为地方特色葡萄酒酵母菌的筛选和选育提供理论基础和研究依据。

酿酒葡萄；酵母菌；分离筛选；分子鉴定

宁夏贺兰山东麓具有典型的气候特征和独特的地理条件，是中国葡萄栽培的最适生态区之一，也是近年来新兴的葡萄酒产区[1]。在传统产区，酵母菌由于逐渐适应了当地的气候条件、土壤和葡萄品种，以及自然选择的作用，形成了适合当地葡萄酒的特有的天然优良酵母菌株分布，具有很强的地域特性，有助于酿酒师酿造出风味复杂而又有品种典型性的独特葡萄酒[2]。

2007年刘爱国等[3]对采集自广夏三基地葡萄园的酵母菌鉴定为6属7种；同时，刘爱国[4]对分离自西夏王陵葡萄园的酵母菌鉴定为4属4种；对筛选于玉泉营农场葡萄园的酵母菌鉴定为4属5种；2008年王惠等[5]对采集自贺兰山东麓产区共18个葡萄品种样品自然发酵，被测酵母菌株鉴定为10属19种。2009年王国平等[6]将御马葡萄酒厂葡萄基地的酵母菌鉴定为5属7种，2009年宋育阳等[7]用蛇龙珠葡萄品种进行自然发酵，对分离的酵母菌进行鉴定得到4属5种；2010年宋育阳等[8]将御马葡萄基地的神索葡萄品种自然发酵，将分离获得的酵母菌鉴定为4属5种。前人的研究表明，宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄酵母菌种类多、资源丰富。

本试验从宁夏贺兰山东麓的西夏王陵、红寺堡、玉泉营、青铜峡、张裕摩塞尔十五世酒庄5个地区葡萄园样品进行分离筛选，采用WL培养基初步分类，并进行分子鉴定，为筛选和选育具有地方特色葡萄酒酵母菌提供理论基础和研究依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试剂与主要仪器

正向引物 NL1（5’-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3’）和反向引物 NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）、酵母基因组DNA提取试剂盒：康为世纪生物科技有限公司；APOLLO PCR仪、BIO-RAD凝胶成像系统美国伯乐公司；SPX-150B智能型生化培养箱：上海琅玕实验设备有限公司；DYCP-31B琼脂糖凝胶电泳系统：北京六一仪器厂等。

1.1.2 培养基

YEPD培养基[9]（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，琼脂20，自然pH值，121℃灭菌20 min；用于酵母菌的分离筛选和菌种保藏。

WL营养琼脂培养基[10]（g/L）：酵母浸粉4，胰蛋白胨 5，葡萄糖 5，琼脂 20，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.425，氯化钙 0.125，氯化铁 0.0025，硫酸镁 0.125，硫酸锰0.002，溴甲酚绿0.022，pH值为6.5左右，121℃灭菌20 min，用于酵母菌的初步形态分类。

1.1.3 酵母菌分离样品来源

宁夏贺兰山东麓的张裕十五世酒庄、西夏王陵、红寺堡、玉泉营、青铜峡葡萄园酿酒葡萄自然发酵的不同时期、葡萄浆果、土壤作为酵母菌的分离样品。

1.2 酵母菌的分离筛选

1.2.1 浆果中酵母菌的分离筛选

称取成熟葡萄浆果1 g，破碎，加入装有9 mL无菌水的三角瓶中，振荡10 min，制成菌悬液，采用梯度稀释的方法，将适宜稀释度菌悬液涂布接种到固体YEPD培养基上，28℃培养1 d～3 d，结合菌落颜色和形态，挑取单菌落，用平板划线法在固体YEPD培养基上纯化，接入斜面，4℃保藏待用。

1.2.2 葡萄园土壤中酵母菌的分离筛选

称取土壤0.1 g，加10 mL无菌水，搅拌均匀，取上清，采用梯度稀释的方法涂布接种到固体YEPD培养基上，28℃培养1 d～3 d，结合菌落颜色和形态，挑取单菌落，用平板划线法在固体YEPD培养基上进一步纯化，接入斜面，4℃保藏待用。

1.2.3 自然发酵过程中酵母菌的分离筛选

发酵过程中酵母菌株的分离：采集成熟葡萄浆果手工破碎后，取葡萄汁（带部分皮渣）置于200 mL三角瓶中，进行自然发酵。分别于发酵前期、中期、后期取1 mL发酵汁，加9 mL无菌水进行梯度稀释涂布，挑取单菌落划线纯化，接入斜面，4℃保藏待用。

1.3 WL培养基对菌株的初步分类[10]

将保藏的不同来源的酵母菌株用液体YEPD培养基活化后，采用梯度稀释涂布的方法接种于WL培养基上，28℃培养3 d～7 d后，观察记录菌落的颜色和形态。

1.4 酵母菌株鉴定

1.4.1 酵母菌株基因组DNA提取

本试验酵母基因组DNA提取方法参照酵母基因组DNA提取试剂盒（康为世纪）提取法。

1.4.2 26S rDNA D1/D2序列的扩增与测序

扩增需要的引物和反应液组成参考刘爱国[3]等试验方法，进行PCR扩增。PCR扩增程序：95℃，5 min；（94 ℃、45 s；52 ℃、1 min；72 ℃、30 s）共 30个循环；72℃，8 min。电泳确认目标产物有无效果。所得PCR产物送交昆泰锐生物公司纯化测序。

1.4.3 酵母菌株序列分析

对所测菌株的26S rDNA D1/D2序列图谱校正，提交GenBank，并在GenBank中进行在线分析（BLAST search），比较测试菌株与酵母菌种模式菌株对应序列的相似程度，对相似度超过99%以上的菌株对其做出种属鉴定[11]。

2 结果与分析

2.1 宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄酵母菌分离筛选结果

本试验共分离筛选到酵母菌122株，其中西夏王陵、红寺堡、玉泉营、青铜峡、张裕十五世酒庄分别分离筛选酵母菌29株、19株、20株、22株和32株。部分酵母菌株分离纯化结果如图1所示。

2.2 宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄酵母菌在WL培养基上的初步形态分类结果

对分别从土壤、浆果、自然发酵过程分离筛选的122株野生酵母菌株，在WL培养基上培养所形成的菌落颜色和形态在体视解剖镜下观察的菌落特征，与Cavazza[12]和Pallman[13]描述的菌落特征对照，初步分类鉴定为10个酵母菌类型，形态特征见图2。

图1 部分酵母菌株分离纯化结果图Fig.1 Some yeast strains and purification results

2.3 宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄酵母菌在WL培养基上的菌落形态

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄酵母菌在WL培养基上的菌落形态见表1～表5。

依据表1的菌落颜色及形态记录与Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征对照，菌落类型Ⅰ为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落类型II为美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落类型 III为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落类型Ⅳ为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落类型Ⅴ为大隐球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落类型Ⅵ为红酵母（Rhodutorula）；菌落类型Ⅶ为葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）；菌落类型Ⅷ未能鉴定。

表1 张裕摩塞尔十五世酒庄酿酒酵母菌WL培养基上的菌落形态描述Table 1 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Chateau Changyu Moser XV on WL nutrient agar

表2 红寺堡葡萄园酿酒酵母菌WL培养基上的菌落形态描述Table 2 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Hongsibu on WL nutrient agar

表3 玉泉营葡萄园酿酒酵母菌WL培养基上的菌落形态描述Table 3 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Yuquanying on WL nutrient agar

表4 青铜峡葡萄园酿酒酵母菌WL培养基上的菌落形态描述Table 4 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Qingtongxia on WL nutrient agar

表5 西夏王陵葡萄园酿酒酵母菌WL培养基上的菌落形态描述Table 5 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Xixia Dynasty on WL nutrient agar

依据表2的菌落颜色及形态记录Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征对照，菌落类型Ⅰ为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落类型II为美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落类型 III为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落类型Ⅳ为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落类型Ⅴ为大隐球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落类Ⅷ未能鉴定。

依据表3的菌落颜色及形态记录与Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征对照，菌落类型Ⅰ为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落类型II为美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落类型 III为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落类型Ⅴ为大隐球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落类型Ⅶ为葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）；菌落类型Ⅸ未能鉴定。

依据表4的菌落颜色及形态记录与Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征对照，菌落类型Ⅰ为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落类型II为美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落类型III为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落类型Ⅳ为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落类型Ⅴ为大隐球酵母（Cryptococcus magnus）。

依据表5的菌落颜色及形态记录与Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征对照，菌落类型Ⅰ为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落类型II为美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落类型III为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落类型Ⅳ为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落类型Ⅴ为大隐球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落类型Ⅶ为葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）；菌落类型Ⅷ、Ⅹ未能鉴定。

2.4 26S rDNA D1/D2鉴定结果

依据酵母菌在WL培养基上的菌落特征及形态分类结果，选出具有代表性的10株酵母菌进行分类鉴定。用校正后的26S rDNA D1/D2区序列在GenBank数据库中进行在线同源序列比对（BLAST search），所得结果如表6。

表6 26S rDNA D1/D2菌株鉴定结果Table 6 26S rDNA D1/D2 Strain identification results

3 结论

对从宁夏贺兰山东麓的葡萄园土壤、葡萄浆果表皮以及葡萄自然发酵过程中获得的122株野生酵母菌株，通过在WL培养基上的通过在培养基上的培养结果，依据菌落颜色及形态记录，可将酵母菌分为10类。菌落类型Ⅰ为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落类型II为美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落类型III为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落类型Ⅳ为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落类型Ⅴ为大隐球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落类型Ⅵ为红酵母（Rhodutorula）；菌落类型Ⅶ为葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）；菌落类型Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ未能鉴定。

依据WL培养基的初步分类，选出具有代表性菌种类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各2株，结合26S rDNA D1/D2区序列分析，可以将菌株分为5类，这5种类型分别为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大隐球酵母（Cryptococcus magnus）。

本试验初步确定宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄产区母菌的主要种类，为地方特色葡萄酒酵母菌的筛选和选育提供理论基础和研究依据。

[1]宋育阳.宁夏贺兰山葡萄酒厂酵母菌的鉴定及多样性研究[D].杨凌:西北农林科技大学硕士论文,2009

[2] 张春芝,莫寅斌.宁夏产区酿酒葡萄酵母菌初步分类鉴定及多样性研究[J].中国酿造,2014,33(10):49-54

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[4] 刘爱国.宁夏贺兰山东麓葡萄酿酒酵母菌的分离及其分类鉴定[D].杨凌:西北农林科技大学,2008

[5] 王慧,张立强,刘天明.葡萄果粒表皮酵母菌多样性研究[J].微生物学通报,2008,35(1):10-14

[6] 王国平,宋育阳,裴颖芳,等.宁夏御马葡萄酒厂野生酵母菌株的分离筛选及分子鉴定[J].中国酿造,2009(8):38-41

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[8] 宋育阳,白稳红,刘延琳.神索葡萄自然发酵酵母菌群研究[J].华中农业大学学报,2010,29(4):513-517

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[10]张春芝,莫寅斌.宁夏产区酿酒葡萄酵母菌初步分类鉴定及多样性研究[J].中国酿造,2014,33(10):49-54

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[13]Heard G.Novel yeasts in winemaking-looking to the future[J].Food Australia,1999,51:347-352

Isolation and Identification of Saccharomyces cerevisiae Strain of East Helan Mountain Area in Ningxia

WANG Zhi-heng，LIU Ya-qin*，FENG Cui-e，LI Ren-jie，CHEN Qi-peng
（College of Biological Science and Engineering，North University for Nationalities，Grape and Wine Innovation Center of Ningxia，Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

In order to further explore the diversity of Saccharomyces cerevisiae of Helan Mountain Area in Ningxia and realize better development and utilization of Saccharomyces cerevisiae resources，the wine grape regions of Mausoleum of Xixia Dynasty，Hongsibu，Yuquanying，Qingtongxia and Chateau Changyu Moser XV were taken as the research object.The Saccharomycetes in the soil was isolated，screened and observed in the natural fermentation process of grape berries epidermis and the fruit.The 122 Saccharomycetes strainswere preliminarily classified based on WL nutrient agar，and 26S rDNA D1/D2 sequence analysis was conducted.Totally，5 kinds of Saccharomycetes were identified in this study，including Pichia kluyveri，Metschnikowia pulcherrima，Hanseniaspora uvarum，Saccharomyces cerevisiae and Cryptococcus magnus.Thus the main species of Saccharomycetes in the wine grape region of Helan Mountain Area in Ningxia was preliminarily determined，which provides theoretical foundation and research basis for the screening and breeding of local Saccharomyces cerevisiae.

wine grape；Saccharomycetes；isolation and screening；molecular identification

2016-09-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.039

北方民族大学区级大学生创新训练计划项目（nxcx2015128）；宁夏葡萄与葡萄酒技术创新中心科研项目（1505）

王志恒（1992—），男（汉），本科在读，专业：生物技术。

*通信作者：刘雅琴（1965—），女（汉），副教授，本科，研究方向：微生物资源开发利用。