UPLC-MS/MS检测运动食品中β-受体激动剂残留

周帅，张飞云

（西安交通大学城市学院，陕西西安710018）

UPLC-MS/MS检测运动食品中β-受体激动剂残留

周帅，张飞云

（西安交通大学城市学院，陕西西安710018）

建立一种超高效液相色谱-串联质谱法检测运动食品中西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗10种β-受体激动剂残留的分析方法。样品前处理用乙腈沉淀蛋白后，采用MCX小柱进行净化和富集。采用Waters Atalantis T3色谱柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）分离，以0.1%甲酸-乙腈为流动相的梯度洗脱模式下，β-受体激动剂在1.0 ng/mL～20.0 ng/mL浓度范围内线性良好，相关系数r2为0.993～0.999，检出限为 0.5 μg/kg，定量限为 1.5 μg/kg，加标回收率达到 78.2%～91.8%。该方法具有前处理简单、净化效果好、灵敏度高和检测速度快的优点，适用于运动食品中西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗等10种β-受体激动剂残留的分离和定量检测。

超高效液相色谱-串联质谱；运动食品；β-受体激动剂

β-受体激动剂是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，国内养殖户一般将其添加到动物饲料中去，这样能够提高饲养动物的胴体瘦肉率，从而卖出好价钱。但是若人体食用含有过量β-受体激动剂药物的动物源性食品后，将会引发恶心、呕吐、激动、失眠、食欲减退等一系列不良反应[1-2]，所以农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定在所有动物源性食品中不得检出此类药物[3]。但一些不法商贩为获取经济利益，仍然非法使用该类药物，这对购买的消费者是一种潜在的危害。所以以动物源性为材料的运动食品也有可能存在β-受体激动剂药物残留的可能，且对此类运动食品中多种β-受体激动剂药物的残留研究报道不多，故本试验对此类动物源性运动食品进行检测研究。

目前常见的β-受体激动剂药物有西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗等。检测方法也有很多，主要有酶联免疫测定法、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、气相色谱-质谱联用法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）、液相色谱-串联质谱联用法（liquid chromatography tandem mass spectrometry ，LC-MS/MS）等[4-9]。已有的方法常有灵敏度不高，前处理烦琐、检测药物单一或重现性不好等问题，很难满足对药物残留的同时确证检测。本试验所用的方法结合了超高效液相色谱的高分离能力和质谱提供结构信息的功能，具有灵敏度高、选择性强的优势。特别是在前处理阶段采用固相萃取技术，对于复杂样品的分析检测，不仅可以避免基质干扰等问题，而且可以起到一个富集目标物的作用，分析鉴定以往难于辨识的痕量成分。本方法针对10种β-受体激动剂类药物残留建立了一种快速简便、专属性强、灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱方法，在实验室的推广可行性较高，可为动物源性运动食品中10种β-受体激动剂类药物残留的监督检验和残留监控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司Agilent 1290，四极杆串联质谱仪：美国AB公司API4000；

西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗10种标准品：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈为色谱纯：美国Fisher Scientific公司。

1.2 超液相色谱条件

色谱柱：WatersAtalantisT3（2.1mm×150mm，3μm）；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流动相 A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流动相梯度洗脱程序：0～2.0 min 80%A；2.0～5.5 min 80%A →30%A；5.5～8.0 min 30%A→80%A；8.0 min 80%A。

1.3 方法

1.3.1 质谱条件的优化

采用针泵连续进样的方式，在正离子模式（ESI+）下，先对各个目标物进行母离子全扫描，然后对其子离子进行全扫描，分别选定定性离子和定量离子，并对喷雾电压、离子源温度、碰撞气、扫描停滞时间、去簇电压及碰撞电压等参数进行优化。

1.3.2 标准曲线的制作

称取相应质量的西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗标准品，配制成浓度为1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ng/mL 的标准溶液，进行质谱仪分析，绘制标准曲线。

1.3.3 样品前处理条件的优化

动物源性运动食品中含有丰富的蛋白质和脂肪类物质，食品基质复杂，对前处理要求高，本试验以目标物的加标回收率为比较依据，对几种常用的提取溶剂以及固相萃取小柱，进行比较，选择较优的前处理条件。

1.3.4 加标回收试验及样品测定

以市售未检测出β-受体激动剂药物的运动食品为空白基质，加入标准混合溶液，选择优化后的前处理条件和仪器条件，上机检测，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

采用针泵连续进样的方式，在正离子模式（ESI+）下，分别对浓度为10 ng/mL的西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗的标准溶液进行母离子全扫描，确定其分子离子，优化各母离子的锥孔电压。再在上述母离子的基础上，对其子离子进行全扫描，选择两组丰度最高的离子，较高的作为定量离子，次之的为定性离子，并对喷雾电压、离子源温度、碰撞气、扫描停滞时间、去簇电压及碰撞电压等参数进行优化。

优化后的质谱参数为：喷雾电压5 500 V、离子源温度500℃、氮气流量30 L/min、扫描停滞时间100 ms，其他质谱参数见表1。

表1 10种β-受体激动剂的多反应监测扫描模式的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for 10 β-agonist drugs

续表1 10种β-受体激动剂的多反应监测扫描模式的质谱参数Continue table 1 Mass spectrometric parameters for 10 β-agonist drugs

依照表1所设定质谱和超高效液相色谱的条件，选择多反应监测模式（multiple reaction monitoring mode，MRM）进行检测，10种β-受体激动剂能在10 min内快速分离，结果如图1所示。

2.2 标准曲线的制作

为了验证西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗在优化好的仪器条件中的线性关系，配制了浓度为 1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ng/mL 的系列混合标准溶液上机进行检测。试验结果表明，10种β-受体激动剂在1.0 ng/mL～20.0 ng/mL内均具有良好的线性关系（r2＞0.99），并得到10种目标组分的LOD均为 0.5 μg/kg，LOQ 均为 1.5 μg/kg，结果见表 2。

2.3提取溶剂的选择

图110 种β-受体激动剂的MRM图Fig.1 MRM chromatogram of 10 β-agonist drugs

在对西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗等10种目标物提取的过程中，目标物易被运动食品中的蛋白质所吸附，所以在前处理过程中既要考虑蛋白质的去除也要避免目标物被蛋白质沉淀所吸附。本试验参考相关文献[10-15]，比较了0.2 mol/L乙酸铵溶液、乙酸乙酯、乙醇、乙腈等4种提取溶剂对10种目标物的提取效果，具体结果见图2。

表2 10种β-受体激动剂的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 2 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 10 β-agonist drugs

图2 提取液对10种β-受体激动剂平均回收率的影响Fig.2 The effect of extract solution on the average recovery rate for 10 β-agonist drugs

结果如图2所示，4种提取溶剂中，当乙酸铵溶液以及乙酸乙酯作为提取溶剂时，样品中的蛋白质沉淀不充分，提取液出现浑浊现象；当乙醇和乙腈为提取溶剂时，样品中的蛋白质沉淀效果明显，提取液易于分离，其中乙醇提取率不及乙腈，乙腈的提取效果最好，回收率最高，所以本试验选择乙腈作为提取溶剂。

2.4 固相萃取柱的选择

运动食品中的基质成分复杂，特别是以动物源性的运动食品中，即使是经乙腈提取后的提取液中也含有很多杂质干扰目标物在仪器上的响应。所以本试验采用固相萃取小柱对提取液进行进一步的净化和富集，并比较了常用的硅胶小柱、中性氧化铝小柱、MCX小柱、HLB小柱以及C18小柱等5种固相萃取小柱对10种β-受体激动剂的净化效果，结果以10种目标物的平均加标回收率作为比较依据。

结果发现，相比较其他几款小柱，MCX小柱对样品提取液的净化效果最好，加标回收率最高。主要是因为在酸性条件下，MCX小柱能够吸附具有一定弱碱性的β-受体激动剂，淋洗液淋洗杂质后，再用碱性有机溶剂进行洗脱，洗脱液较为干净，杂质少，能对提取液起到很好的净化效果。

2.5 加标回收与相对偏差

在上述优化后的前处理条件仪器条件下，利用空白基质的样品进行加标回收率试验，在分别添加0.5、5.0、20.0 μg/kg等3个浓度梯度的标准混合溶液，每个浓度平行测定5次，测定结果见表3。

表3 方法的回收率及相对标准偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表3可见，10种β-受体激动剂的加标回收率为78.2%～91.8%，相对标准偏差（RSD）为1.9%～3.9%，表明本试验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。

2.6 实际样品的测定

利用本试验优化后处理方法及检测方法，对市场上随机购买的20个批次动物源性运动食品进行测定，结果良好，未发现上述10种β-受体激动剂的残留。并且利用农业部1025号公告-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》[16]，对适用于该标准的9种β-受体激动剂进行复检，结果20个批次动物源性运动食品也未检测出阳性样品，表明该方法实际可行，可用于实际样品的测定。

3 结论

建立一种超高效液相色谱-串联质谱检测动物源性运动食品中西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗等10种β-受体激动剂残留的分析方法。结果表明，通过优化后的质谱条件，在MRM扫描模式下，10种β-受体激动剂组分能在10 min实现快速分离检测。样品经过乙腈提取后，提取液再采用MCX小柱可有效去除样品中的复杂基质，可实现对目标物质的净化与富集，能准确快速有效地检测动物源性运动食品中的西马特罗、特步他林、沙丁胺醇、菲诺特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、妥布特罗、苯乙醇胺A和喷布特罗等10种β-受体激动剂的药物残留。

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Analysis β-Agonist Drugs Residues in Sports Food by UPLC-MS/MS

ZHOU Shuai，ZHANG Fei-yun
（Xi'an Jiaotong University City College，Xi'an 710018，Shaanxi，China）

A ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry analysis method was established for the residues determination of cimaterol，terbutaline，salbutamol，fenoterol，rackdopamine，clorprenaline，clenbuterol，tulobuterol，phenylethanolamine A and penbutolol in sports food.After treated with acetonitrile，the sample concentrated and purified by MCX solid phase extraction column.The separation of targeted compound was performed on a Waters Atalantis T3 chromatographic column（2.1 mm×150 mm，3 μm）using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase under gradient elution mode.The linear range of β-agonist drugs components was in the range of 1.0 ng/mL-20.0 ng/mL with a correlation coefficient of 0.993-0.999.The detection limit was 0.5 μg/kg and the quantitative limit was 1.5 μg/kg.The recovery rate was 78.2%-91.8%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fast detection rate，and is suitable for the separation and quantitative detection of cimaterol，terbutaline，salbutamol，fenoterol，rackdopamine，clorprenaline，clenbuterol，tulobuterol，phenylethanolamine A and penbutolol in sports food.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；sports food；β-agonist drugs

2017-02-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.033

周帅（1982—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：运动训练。