HPLC法检测巧克力中微量异黄酮的研究

赵佳慧，裴晶莹，李晓磊，刘博，李丹

（长春大学农产品加工吉林省普通高等学校重点实验室，吉林长春130022）

HPLC法检测巧克力中微量异黄酮的研究

赵佳慧，裴晶莹，李晓磊*，刘博，李丹

（长春大学农产品加工吉林省普通高等学校重点实验室，吉林长春130022）

巧克力由于含有大量脂肪、蛋白质以及碳水化合物等成分，给异黄酮的提取带来很大干扰，为了能更加准确地检测巧克力中的微量异黄酮含量，采用研磨粉碎、以甲醇为溶剂超声波辅助的方法对巧克力中的异黄酮进行提取。然后采用高效液相色谱仪进行定性定量检测，以C18色谱柱为分离柱，以甲醇/水/甲酸为流动相，在30 min内，以0.8 mL/min的流速梯度洗脱（从20/80/0.1到80/20/0.1）巧克力的甲醇提取物，紫外检测器的波长设为254 nm。结果表明：巧克力中总异黄酮含量为0.41%。利用这种方法可以准确的检测巧克力中微量异黄酮含量。

巧克力；异黄酮；高效液相色谱

人们在豆类和谷类等多种植物中发现了大豆异黄酮类物质，而且专家指出，大豆异黄酮与人体雌性激素有着惊人的相似之处。大豆异黄酮在女性保健方面具有显著的作用，适当的摄入大豆异黄酮，不仅能够调节人体激素分泌，还可以促进生长因子的活性。现代医学已经证明：大豆异黄酮可以推迟女性更年期，并且具有延缓女性衰老的作用。研究表明，对于长时间食用豆类食品的人群，其乳腺癌以及前列腺癌的发生率与病死率相对较低，进而表明乳腺癌、前列腺癌等发病率均与大豆的摄取呈负相关性[1]。因此，大豆异黄酮具有抗癌作用。

然而，人们要想通过大豆来摄入异黄酮是有局限性的。主要在于大豆含有大量棉子糖和水苏糖，容易引起人体腹部饱胀，胃肠不适；一些肾病患者和痛风患者也不宜食用大豆；部分年轻女性因个人喜好较少甚至不食用大豆。

目前，大豆异黄酮的保健食品类型比较单调并且服用不便，主要是以胶囊、片剂的形式存在。在美国召开的第一届和第二届国际大豆防治慢性病的会议上，专家一致认为深入研究大豆异黄酮具有重要的理论意义和应用价值[2]。因此，有必要开发含大豆异黄酮的多种食品。

巧克力口感甜美且具有一股浓郁的香气，体积小便于携带，颇受现代年轻女性的青睐。因此在巧克力中加入异黄酮不仅食用起来比较便捷，还可以达到保健作用。由此可见，加入大豆异黄酮的巧克力具有广阔的市场发挥空间。本论文建立了一种检测巧克力中微量异黄酮的方法，旨在为这类新型异黄酮食品的生产、质量控制、人体试验，提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

巧克力样品：由国家大豆深加工技术研究推广中心李荣和教授提供。

染料木苷（genistin）、大豆苷（daidzin）、染料木素（genistein）、大豆素（daidzein）标准品：购自美国 Sigma公司；甲醇（色谱纯）：购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆热电飞世尔科学有限公司；二次蒸馏水：长春大学农产品加工吉林省普通高等学校重点实验室自制；其他均为国产分析纯试剂。

舒美KQ-300VDE超声波清洗机：昆山超声仪器有限公司；滤膜（聚四氟乙烯）：丰源过滤设备有限公司；Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪：岛津，日本东京；安捷伦XDB-C18色谱柱：美国安捷伦。

1.2 大豆异黄酮粉溶液的配制

精确称取大豆异黄酮粉5.0 mg，置25 mL容量瓶中，以蒸馏水溶解，并定容至刻度，摇匀作为对照溶液。

1.3 巧克力异黄酮的提取

将巧克力用研钵进行研磨。取2.0 g巧克力颗粒，加入100 mL容量瓶，再加入甲醇至刻度线，在超声波清洗机中以20、45、100 kHz三频交替提取1 h；待冷却至室温后，再补充甲醇定容至刻度线，并混匀。以0.45 μm孔径的微孔滤膜过滤，所得滤液用于高效液相色谱分析。

1.4 异黄酮含量的测定

采用高效液相色谱仪测定条件为色谱柱3.5 μm（150 mm×4.6 mm）；流动相，A：甲醇/水/甲酸（20/80/0.1，体积比）；B：甲醇/水/甲酸（80/20/0.1，体积比）；洗脱梯度：0 min，100%A；0～30 min 内，B 由 0 线性增加到100%；UV检测器，检测波长254 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：30℃；进样体积：20 μL。采用标准曲线法定量染料木苷、大豆苷、染料木素、大豆素。

2 结果与讨论

2.1 巧克力中异黄酮提取方法的选择

大豆异黄酮的提取方法有很多种，如溶剂萃取法、超临界流体萃取法、微波萃取法和超声波萃取法。溶剂萃取法虽然操作简单，但有溶剂残留，产品回收率低，纯度低，对试验结果有一定影响。微波萃取法可缩短萃取时间，提高萃取率，但耗能大成本高，也不适合用于试验研究。超声波提取法常作为溶剂萃取法的辅助方法，其原理是空化作用对细胞膜的破坏有助于异黄酮类化合物的释放与溶出，超声波使提取液不断振荡，有助于溶质扩散[3-4]。高荣海等[5]对溶剂提取法和超声波辅助提取法从脱脂豆粕中提取大豆异黄酮进行了比较研究，结果表明超声波辅助提取法的得率和质量分数均略高于乙醇回流提取法的得率和质量分数，而且超声波辅助提取法具有提取时间短的优点，是提取大豆异黄酮较为理想的方法。综合考虑，决定选用超声波提取法进行检测。

2.2 巧克力中异黄酮提取溶剂的选择

有机溶剂萃取法是国内外提取大豆异黄酮使用最广泛的方法，常用的有机溶剂有：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷以及它们的水溶液或混合溶液[6-7]。

由于异黄酮在溶剂中的溶解性能相差很大，没有一种能适合所有异黄酮成分的提取溶剂，所以必须根据目标成分的性质及杂质的类别来选择溶剂。一般极性溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等适合于提取各种异黄酮苷。最常选用的提取溶剂是乙醇，其毒性小、且与水混和可以得到不同的极性，所以一般使用70%的乙醇进行提取大豆异黄酮[8]。

但因巧克力中异黄酮含量较低，且巧克力中含有碳水化合物、蛋白质和脂肪等成分不易提取分离。因此本研究用甲醇为溶剂萃取，以提高异黄酮的得率。

2.3 巧克力中异黄酮的高效液相色谱定性分析

试验采用较低成本的水、甲酸和甲醇混和液为流动相，进行梯度洗脱，经过C18色谱柱后，在UV254 nm进行检测。大豆异黄酮粉甲醇提取物异黄酮高效液相色谱图如图1所示，巧克力甲醇提取物异黄酮高效液相色谱图如图2所示。

图1 大豆异黄酮粉甲醇提取物异黄酮高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of isoflavones from soybean isoflavone

由图1和图2可以看出，大豆异黄酮粉中的异黄酮和从巧克力中提取的异黄酮的高效液相色谱图峰值的时间比较相似。

图2 巧克力甲醇提取物异黄酮高效液相色谱图Fig.2 HPLC of the methanol extract of chocolate

采用染料木苷、大豆苷、染料木素、大豆素标准品进行定性分析表明：巧克力甲醇提取物HPLC色谱中保留时间12.615 min的色谱峰为大豆苷，染料木苷的保留时间为24.230 min，保留时间15.340 min的色谱峰为染料苷，大豆素的保留时间为21.662 min。在前12.615 min和24.230 min后有较小的未知峰，在本研究所用的色谱条件下对异黄酮组分的确定和定量分析产生的影响可以忽略。

以上的结果表明：巧克力中染料木苷的含量最多，但与大豆异黄酮粉中的异黄酮含量相比，巧克力中异黄酮的各种成分含量相对偏低。

2.4 巧克力异黄酮的含量

根据大豆苷、大豆素、染料苷和染料木苷的标淮曲线，对巧克力中异黄酮各成分含量进行计算，取平均值得出最终结果，如表1所示。

表1 巧克力中异黄酮含量Table 1 Isoflavone content in chocolate %

由表1可知，巧克力中总异黄酮的平均含量为0.41%。

3 结论与讨论

采用高效液相色谱仪进行定性定量检测，以C18色谱柱为分离柱，以甲醇/水/甲酸为流动相，在30 min内，以0.8 mL/min的流速梯度洗脱（从20/80/0.1到80/20/0.1）巧克力的甲醇提取物，紫外检测器的波长设为254 nm。结果表明：巧克力中总异黄酮含量为0.41%。利用这种方法可以准确的检测巧克力中微量异黄酮含量。

对巧克力进行预处理，然后用甲醇超声波提取异黄酮，再利用高效液相色谱法定性定量，可以准确的分析巧克力中异黄酮的种类和含量。人体每天摄入异黄酮的含量标准是80 mg，一块巧克力的质量大约是10 g，经计算每天吃两块巧克力即可达到异黄酮的摄入标准。

[1] 李玉珍,林亲录,肖怀秋,等.大豆异黄酮的功能特性研究进展[J].中国食物与营养,2005(10):21-22

[2] 谢明杰,高爽,刘长江,等.大豆异黄酮生理功能的研究进展[J].食品与发酵工业,2004,30(5):94-98

[3] 潘廖明,姚开,贾冬英,等.超声波提取大豆异黄酮[J].中国油脂,2003,28(11):85-87

[4] 谢明杰,宋明,邹翠霞,等.超声波提取大豆异黄酮[J].大豆科学,2004,23(1):75-76

[5] 高荣海,赵秀红,郑艳,等.大豆异黄酮提取工艺的比较研究[J].粮食加工,2008,33(4):41-44

[6] 李长江,张蔡华.大豆异黄酮提取工艺研究[J].黄山学院学报,2009,8(3):56-58

[7] 王葭.大豆异黄酮的研究进展[J].河北师范大学学报,2002,26(1):74-77

[8]李丹,李晓磊.高效液相色谱法检测大豆酸乳中微量异黄酮的研究[J].长春大学学报,2008,18(5):61-64

Study on Determination of Trace Isoflavones in Chocolate by HPLC

ZHAO Jia-hui，PEI Jing-ying，LI Xiao-lei*，LIU Bo，LI Dan
（Jilin Key Lab of Agricultural Products Processing in Changchun University，Changchun 130022，Jilin，China）

Fat，protein and carbohydrates in chocolate have a great negatively effect on the extract of isoflavones.In order to more accurately detect the content of trace isoflavones in chocolate，ultrasonic extraction in methanol and HPLC with a C18 column were used.The chromatography was performed at a flow rate of 0.8 mL/min using the mobile phase methanol/water/formic acid from 20/80/0.1 to 80/20/0.1 in 30 min.UV detector wavelength was set to 254 nm.The results showed that the content of total isoflavones in chocolate was 0.41%.This method could be used to detect the trace isoflavones in chocolate.

chocolate；isoflavone；high performance liquid chromatography

2016-09-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.028

国家自然科学基金“青年科学基金项目”（NSFC-31000760）

赵佳慧（1993—），女（汉），硕士研究生，研究方向：功能食品和生物技术。

*通信作者：李晓磊，女（汉），副教授，博士，主要从事功能食品和生物技术的研究。