超声波辅助提取荷花粉总黄酮工艺优化研究

李鑫玲，龚明贵，李欣，张慧芸，张仲欣

（河南科技大学食品与生物工程学院河南省食品原料工程技术研究中心，河南洛阳471023）

超声波辅助提取荷花粉总黄酮工艺优化研究

李鑫玲，龚明贵，李欣，张慧芸，张仲欣

（河南科技大学食品与生物工程学院河南省食品原料工程技术研究中心，河南洛阳471023）

采用超声波辅助提取荷花粉中的总黄酮，利用单因素试验和响应面方法优化总黄酮的最佳提取工艺，研究液固比、乙醇浓度、超声处理温度和提取时间对总黄酮提取率的影响。结果表明，当超声波功率250 W条件下，超声波辅助提取荷花粉总黄酮最佳工艺参数为液固比18.5（mL/g），乙醇浓度82%，提取温度74℃，提取时间53 min，总黄酮的提取率可达1.658 2%。

荷花粉；响应面法；超声波；黄酮

花粉作为植物的精华，含有蛋白质、多种维生素、氨基酸、矿物质、多酚及黄酮和多糖等200多种人体必需的营养成分和生物活性物质[1]，是迄今为止发现的最全面的营养物质之一，被誉为“完全营养食品”、浓缩的营养库”[2]。作为一种新型的保健食品，它能降血压、防止血管硬化，同时还具有较强的抗氧化活性，是目前食用医疗保健研究的一大热点[3]。黄酮化合物是次生代谢产物，是花粉中的重要营养成分之一，具有较强的抗氧化、抗疲劳及抗菌活性，同时还具有增强免疫力、清除体内自由基等多重功效[4]。

荷花是睡莲科植物莲的蓓蕾，在我国分布广泛，栽培面积大，品种繁多。荷花粉作为一种新兴花粉保健品，黄酮类含量高、种类多，营养丰富，具有抗氧化、降血脂、护血管、预防癌症和润肤美容的功效，备受广大消费者的青睐[5]。胡卫成[6]等的研究结果表明，利用超声波辅助提取可以强化提取效果，缩短提取时间，提高原料的利用率。目前，对于荷花粉黄酮的超声辅助提取及条件优化缺乏系统研究。

本试验以荷花粉为原料，利用响应面法超声波辅助对荷花粉中总黄酮的提取条件研究，并选择出最优的提取条件，这将为扩大荷花粉的开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荷花粉：河南普瑞蜂业有限公司，烘干至恒重，经粉碎机粉碎后，过100目分样筛，即得荷花粉样品；芦丁（CAS号：153-18-4）：上海源叶生物科技有限公司；硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠和亚硝酸钠均为分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 荷花粉总黄酮类化合物的含量测定

采用NaNO2-A1（NO3）3-NaOH显色体系吸光光度法测定芦丁标准曲线，并测定样品总黄酮的含量[7]。以芦丁浓度（C：mg/mL）对吸光度（A）进行线性回归，回归方程为：A=0.013 8 C-0.026 5（R2=0.999 4）。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验设计

超声功率、乙醇浓度、提取温度、提取时间、液固比对黄酮的提取率有显著影响[8]，因此选取这5个因素作为考察指标，分析不同提取条件对荷花粉总黄酮提取效果的影响。单因素试验设计如表1。

表1 单因素水平设计Table 1 Single factor level design

1.3.2 响应面试验设计

在初步试验结果的基础上，确定适用于试验的因素范围，然后进行响应面试验。采用通用旋转组合设计[9]，用于评价液固比（X1）、乙醇浓度（X2）、提取温度（X3）和提取时间（X4）4个独立变量对荷花粉中总黄酮提取率（Y）的影响。因素水平编码表见表2。

表2 因素水平编码表Table 2 Factor level design

如表2所示，独立变量编码在5个水平（-2、-1、0、1、2），完整的设计包括 31个试验点，中心试验点重复7次（所有变量编码为零）。

1.3.3 数据分析

本试验采用响应面分析法中Central Composite原理进行回归试验，通过DPS（V3.01）和Design Expert 8.05统计软件进行数据分析，以得到各变量和提取率之间的回归方程。根据试验数据，构建拟合模型（见公式1），模型的显著性通过回归分析和方差分析进行检验，最终确定超声法提取荷花粉总黄酮的最佳提取条件。

式中：Y 为提取率，%；β0为常系数；βi为线性系数；βii为线性二次系数；βij为交互系数；Xi和 Xj均为各独立变量的水平编码。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液固比对荷花粉总黄酮提取率的影响

参考相关文献，固定超声功率250 W[10-11]、乙醇浓度40%、提取温度40℃、提取时间10 min，研究不同液固比 9、12、15、18、21、24 mL/g 对荷花粉总黄酮提取率的影响。液固比对荷花粉黄酮提取率的影响见图1。

图1 液固比对荷花粉总黄酮提取率的影响Fig.1 Influence of solvent to solid ratio on the extraction yield of flavonoids from lotus powder

如图1所示，当液固比从9 mL/g增至18 mL/g时，总黄酮提取率显著增加并达到最高点1.42%，随后逐渐降低。因此选择 16、17、18、19、20（mL/g）5 个水平用于响应面试验。

2.1.2 乙醇浓度对荷花粉总黄酮提取率的影响

固定超声功率250 W、液固比18 mL/g、提取温度40℃、提取时间10 min。研究不同乙醇浓度40%、50%、60%、70%、80%、90%对荷花粉总黄酮提取率的影响。乙醇浓度对荷花粉总黄酮提取率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对荷花粉总黄酮提取率的影响Fig.2 Influence of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids from lotus powder

从图2可以看出，黄酮提取率随着乙醇浓度逐渐增大，当浓度增至80%时达到最高，继续增大，提取率降低。另外，随着乙醇浓度的继续增大，溶剂中的脂溶性物质也不断增多，这将给进一步提纯带来麻烦。考虑到成本和提取率，较适乙醇浓度为80%。

2.1.3 超声处理温度对荷花粉总黄酮提取率的影响

固定超声功率250 W、液固比18 mL/g、乙醇浓度80%、提取时间10 min，研究不同超声处理温度40、50、60、70、80、90℃对荷花粉总黄酮提取率的影响。超声处理温度对荷花粉总黄酮提取率的影响见图3。

图3 超生处理温度对荷花粉总黄酮提取率的影响Fig.3 Influence of ultrasonic treatment temperature on the extraction yield of flavonoids from lotus powder

如图3所示，随着温度的增加，总黄酮提取率逐渐上升，然后在70℃时达到峰值，继续增大提取温度，提取率则不断下降。这种现象可以解释为，随着温度的升高，溶剂的黏性下降、分子运动加剧，有利于生物活性物质从植物细胞释放。然而，更高的温度促进了一些热敏物质的降解[12]。因此选择 60、65、70、75、80 ℃ 5个水平用于响应面试验。

2.1.4 提取时间对荷花粉总黄酮提取率的影响

固定超声功率250 W、液固比18 mL/g、乙醇浓度80%、提取温度 70℃，研究不同提取时间 10、20、30、40、50、60 min对荷花粉总黄酮提取率的影响。提取时间对荷花粉总黄酮提取率的影响见图4。

图4 提取时间对荷花粉总黄酮提取率的影响Fig.4 Influence of extraction time on the extraction yield of flavonoids from lotus powder

从图4可以看出，随着提取时间从10 min增至50 min，总黄酮提取率显著增大，当增至50 min时达到一个峰值，随后逐渐降低。充足的浸提时间可以提高黄酮化合物的溶出率，但提取时间过长又会造成活性成分的损失[13]。因此选择 40、45、50、55、60 min 5 个水平用于响应面试验。

2.2 响应面分析

2.2.1 模型拟合与统计分析

根据单因素试验结果，在超声功率250 W条件下，采用DPS v7.05数据处理软件，根据表2设定的因素和水平，实施31次试验，试验结果见表3。

表3 四元二次通用旋转组合设计试验结果Table 3 Second-order rotation combination experimental design with experimental results

根据试验数据，构建拟合模型，得到黄酮的提取得率（Y）为响应值，液固比（X1）、乙醇浓度（X2）、提取温度（X3）、和提取时间（X4）为自变量的回归方程为：Y=-77.754 23+1.489 29X1+0.640 60X2+0.607 33X3+0.645 48X4+0.005875X1X2+0.006125X1X3-0.001375X1X4-0.001175X2X3-0.002375X2X4+0.000275X3X4-0.063348X12-0.003 283 93X22-0.004 333 93X32-0.004 233 93X42

方差分析用于检测模型的显著性和回归方程的拟合程度，分析结果见表4。

表4 试验结果方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model equation

P值用于检测各因素对Y值的影响是否显著，同时也用于检测各因素之间的交互作用是否显著。P值越小模型越显著[14]，由表4可知，P值小于0.000 1，说明该模型对本试验是合适的。决定系数（R2=0.983 8）接近1，说明该模型与实际数据相关性较好；调整后的R2为0.969 6，说明回归方程中对荷花粉总黄酮得率的影响有96.96%可以通过该模型进行预测，仅有3%的变化因素不能通过该模型进行解释。

失拟是指回归方程中未包含的变化因素，由方差分析结果可得，失拟项（F=1.300 849，P=0.388 7＞0.05）不显著，进一步证明回归方程的可行性[15]。

由表4可知，回归方程显著（P＜0.01），失拟不显著（P＞0.05），说明该方程能较好模拟各因素对荷花粉总黄酮提取效果的影响提取的各个因素X1（液固比）X2（乙醇浓度）X3（提取温度）和X4（提取时间）对提取率的影响都达到极显著水平（P＜0.01）因素对提取率的影响不存在线性关系，它们中的一些交互项对提取率的影响是显著的。研究结果还表明，影响荷花粉中总黄酮提取率最重要的参数是X3（提取温度）和X4（提取时间），其次是X2（乙醇浓度）和X1（液固比），其中X3（提取温度）＞X4（提取时间）＞X2（乙醇浓度）＞X1（液固比）。

2.2.2 响应面分析

选取2个交互的因素对荷花粉总黄酮提取率进行响应面分析，其它两个因素被保持在0水平。液固比和提取温度交互作用对总黄酮提取率影响的响应面见图5，乙醇浓度和提取时间交互作用对总黄酮提取率影响的响应面见图6。

由图5可知，当其它两个因素在零水平保持不变，液固比和乙醇浓度的交互作用显著；由图7可以看出，当提取时间一定时，随着乙醇浓度的增加提取率显著升高，另外当乙醇浓度不变时，提取率随着提取时间的延长而增大。

响应面分析结果显示，荷花粉中总黄酮提取率显著增加取决于乙醇浓度、提取时间和提取温度，而固液比对提取率没有显著的影响，这与方差分析结果相一致。

2.2.3 优化与验证

通过使用Design Expert 8.05统计软件进行响应面优化，获得荷花粉总黄酮提取率的最佳工艺参数为液固比 18.55∶1（mL/g），乙醇浓度 81.90%，提取温度73.74℃，提取时间52.64 min，提取率预测值为1.668 91%；考虑到试验的可操作性，将最佳工艺参数修正为液固比18.5∶1（mL/g），乙醇浓度 82%，提取温度74℃，提取时间53 min。采用最佳工艺参数进行3次平行试验，得到总黄酮的提取率的均值为（1.658 2±0.007）%，与预测值基本相符。

图5 液固比和提取温度交互作用对总黄酮提取率影响的响应面Fig.5 Response surface plots for the effect of liquid/solid ratio and extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids

图6 乙醇浓度和提取时间交互作用对总黄酮提取率影响的响应面Fig.6 Response surface plots for the effect of ethanol concentration and extraction time on the extraction yield of total flavonoids

3 结论

通过Central Composite设计试验得出回归模型决定系数（R2=0.983 8）接近1，说明该模型与实际数据相关性较好，可以通过该模型进行预测荷花粉黄酮的提取率；影响荷花粉中总黄酮提取率最重要的参数是X3（提取温度）和X4（提取时间）；超声辅助提取荷花粉总黄酮最佳工艺参数为液固比18.5（mL/g），乙醇浓度82%，超声处理温度74℃，提取时间53 min，总黄酮的提取率可达1.658 2%，与预测值基本相符。

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Process Optimization Study on Lotus Powder Flavonoids Extraction by Ultrasonic Assisted

LI Xin-ling，GONG Ming-gui，LI Xin，ZHANG Hui-yun，ZHANG Zhong-xin
（Food Materials Engineering Technology Research Center of Henan Province，College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，Henan，China）

This study aimed to optimize the ultrasonic treatment parameters for total flavonoids extracted from lotus power by single factor tests and response surface methodology.Effects of liquid-solid ratios，ethanol concentration，ultrasonic treatment temperature and time on extraction yield of total flavonoids were studied.Results showed that the optimum ultrasonic assisted extraction parameters were liquid-solid ratios of 18.5（mL/g），ethanol concentration of 82%，ultrasonic treatment temperature of 74℃，extraction time of 53 min under ultrasonic power 250 W.Extraction yield of total flavonoids achieved 1.658 2%under the optimum parameters.

lotus powder；response surface methodology；ultrasonic wave；flavonoid

2016-10-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.015

李鑫玲（1982—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：天然产物化学。