宁夏无果枸杞芽水提物对老年小鼠心肌细胞抗氧化及凋亡蛋白表达的影响

马新伟，刘 郎，曹羿堃，严 青，秦 毅，贾 桦，张莲香，4△

(1.宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川 750004;2.宁夏医科大学总医院，银川 750004;3.宁夏回族自治区石嘴山市第一人民医院 753600;4.宁夏颅脑疾病重点实验室,银川 750004)

论著·基础研究

宁夏无果枸杞芽水提物对老年小鼠心肌细胞抗氧化及凋亡蛋白表达的影响

马新伟1，刘 郎2#，曹羿堃3，严 青1，秦 毅1，贾 桦1，张莲香1，4△

(1.宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川 750004;2.宁夏医科大学总医院，银川 750004;3.宁夏回族自治区石嘴山市第一人民医院 753600;4.宁夏颅脑疾病重点实验室,银川 750004)

目的 观察宁夏无果枸杞芽水提物对老年小鼠心肌细胞抗氧化能力及凋亡相关蛋白表达的影响。方法 将13个月龄自然衰老的C57BL/6J小鼠分为老年对照组和AEFLS低剂量组(AEFLS1组)、AEFLS中剂量组(AEFLS2组)、AEFLS高剂量组(AEFLS3组)。AEFLS1组、AEFLS2组、AEFLS3组分别给予5、10、20 mg/kg的AEFLS灌胃，老年对照组灌胃生理盐水，连续8周。分别用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定心脏组织SOD和MDA的水平；Western-blot技术和免疫组织化学方法检测小鼠心肌组织Bcl-2、Bax和Capase-3的表达。结果 与老年对照组比较，AEFLS2和AEFLS3组MDA水平降低，SOD活性升高,差异有统计学意义(P<0.01)。 Western-blot结果：与老年对照组比较，AEFLS2和AEFLS3组的Bcl-2蛋白光密度值升高，Bax和Capase-3蛋白光密度值降低(P<0.01)；免疫组化结果：与老年对照组比较，AEFLS2和AEFLS3组Bcl-2 蛋白免疫阳性表达均升高，Bax和Capase-3蛋白免疫阳性表达降低(P<0.01)。结论 中、高剂量的 AEFLS 能提高衰老小鼠的心肌组织抗氧化能力，上调Bcl-2的表达，下调Capase-3和Bax的表达，发挥抗心肌细胞凋亡的作用。

衰老；无果枸杞芽；心脏；抗氧化；凋亡

研究表明，随着年龄的增加心脏功能逐渐减退，其主要原因一方面老年心肌细胞不能再生，另一方面随着年龄的增长心肌细胞的丢失增多，而这种心肌细胞的丢失以细胞凋亡为主[1-2]。故通过药物干预延缓或减少心肌细胞凋亡，进而延缓增龄造成的心功能的减退是研究的重点。枸杞为传统的抗衰老中药，无果枸杞芽为无果枸杞树上采摘的嫩芽，作者研究发现无果枸杞芽提取物可提高衰老小鼠脑组织抗氧化能力[3-4]，发挥抗衰老作用，但关于对心肌细胞衰老的影响少见报道。本研究拟观察无果枸杞芽水提物(AEFLS)对老年小鼠心肌组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平及凋亡蛋白表达的影响，为探讨其抗心肌细胞衰老机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 酶标仪(上海)，RE501旋转蒸发器(上海)，冰冻切片机(德国，Leica公司)，电泳仪、转移槽、凝胶成像仪(Bio-Rad公司)。蛋白测定试剂盒、SOD、MDA检测试剂盒(南京建成生物研究所)，蛋白提取试剂盒、兔抗人Bcl-2、Bax和Capase-3 多克隆抗体、SP试剂盒(Santa Cruz公司)。

1.2 实验动物及分组 取健康SPF级C57BL/6J雄性小鼠13月龄60只，老年小鼠月龄的确定参考方喜业主编的《医学实验动物学》[5]，小鼠由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(宁)(2005-0001)，随机分为AEFLS低剂量组(AEFLS1)、AEFLS中剂量组(AEFLS2)、AEFLS高剂量组(AEFLS3)和老年对照组，每组15只。

1.3 方法

1.3.1 无果枸杞芽水提物的制备及给药方法 取无果枸杞芽干品(宁夏杞芽食品科技有限公司提供，批号0955A0111)1 kg 浸泡12 h，煎煮5 h,过滤取出药液，药渣加冷水再煎，反复3次，合并药液，静置沉淀，用4层纱布过滤 3次，煎出的药液放到小火上煎煮蒸发浓缩，使它逐渐形成稠膏状。制备的无果枸杞芽水提物每克膏相当于3.17 g生药。根据《中国药典》成人(体质量60 kg为参考)中草药的剂量与小鼠(体质量20 g为参考)用药剂量进行换算，将水提物分为3个剂量5、10、20 mg/kg，按0.2 mL/10 g溶解在蒸馏水中，以灌胃的方式给予，1次/天，持续8周，对照组灌胃等量生理盐水。

1.3.2 取材 将各组小鼠取5只，用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，取材做石蜡包埋备用。

1.3.3 小鼠心脏组织SOD和MDA含量的测定 各组小鼠取5只断头处死，取左心室称重，按1∶15的比例加入蛋白裂解液匀浆，4 ℃ 4 500 r/min离心15 min，取上清液，进行蛋白定量，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，其余蛋白-80 ℃保存。

1.3.4 Western-blot技术检测Bcl-2、Bax和Capase-3蛋白的表达 取已提取的蛋白按照Western-blot操作步骤检测Bcl-2、Bax和Capase-3蛋白的表达，用Bio-Rad分析系统得到相对光密度比值。

1.3.5 免疫组化SP法检测Bcl-2、Bax和Capase-3蛋白的表达 制备5 μm石蜡切片进行免疫组织化学染色，具体步骤按照免疫组化SP法操作说明书进行，光学显微镜下观察。Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白免疫反应阳性表现为棕色或棕黄色颗粒,阳性颗粒定位于细胞胞浆中。每张切片于阳性表达区域选择5个无重复视野，用图像分析系统分析其光密度值。

2 结 果

2.1 各组SOD和MDA水平 与老年对照组比较，AEFLS2和AEFLS3组心肌组织SOD活性明显增加，AEFLS3组MDA水平明显下降(P<0.01)；AEFLS1组SOD活性及AEFLS1、AEFLS2组MDA水平无明显变化(P>0.05)。与AEFLS1组比较，AEFLS2和AEFLS3组心肌组织SOD活性明显增加(P<0.01)；AEFLS3组MDA水平明显下降(P<0.01)。 见表1。

2.2 SP法检测小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达 各组小鼠心肌细胞均可见Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白免疫阳性细胞，阳性细胞为棕黄色，免疫阳性颗粒主要表达在胞浆。各组分别选取5个高倍视野，统计免疫阳性细胞的光密度值，结果见图1、2、3。Bcl-2免疫阳性细胞：与老年对照组比较，AEFLS1组阳性细胞光密度值差异无统计学意义(P>0.05)； AEFLS2组和AEFLS3组免疫反应阳性细胞光密度值明显增加(P<0.01)。与AEFLS1组比较，AEFLS2组和AEFLS3组免疫阳性细胞的光密度值增加(P<0.01)。Bax及Caspase-3免疫阳性细胞光密度值：老年对照组及AEFLS1组Bax及Caspase-3免疫阳性细胞光密度值较高，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；AEFLS2组和AEFLS3组明显降低，与老年对照组及AEFLS1组比较，AEFLS2组和AEFLS3组蛋白光密度值减小(P<0.01)；AEFLS2组和AEFLS3组光密度值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组小鼠心肌组织SOD和MDA水平比较

*：P<0.01，与老年对照组比较；#：P<0.01，与AEFLS1组比较。

A:对照组;B：AEFLS1组；C：AEFLS2组；D：AEFLS3组。

图1 各组Bcl-2蛋白的表达(Bar:50 μm)

A:对照组;B：AEFLS1组；C：AEFLS2组；D：AEFLS3组。

图2 各组Caspase-3蛋白的表达(Bar:50 μm)

*：P<0.01,与对照组比较；#：P<0.01，AEFLS1组比较。

图3 各组Bcl-2、Capase-2蛋白免疫阳性细胞的平均光密度值

*：P<0.01,与对照组比较；#：P<0.01，AEFLS1组比较。

图4 各组Wester-blot检测结果

2.3 Western Blot技术Bcl-2、Bax和Caspase-3的相对光密度比值 与老年对照组比较，AEFLS1组Bcl-2蛋白相对光密度比值差异无统计学意义(P>0.05)；AEFLS2和AEFLS3组Bcl-2蛋白的光密度比值明显增高(P<0.01)。与AEFLS1组比较，AEFLS2和AEFLS3组Bcl-2 蛋白光密度比值亦明显增高(P<0.01)；AEFLS2组 与AEFLS3组比较，Bcl-2 蛋白光密度比值差异无统计学意义(P>0.05)。Bax和Caspase-3蛋白相对光密度比值：与老年对照组比较，AEFLS1组两种蛋白的光密度比值差异无统计学意义(P>0.05)；AEFLS2组和AEFLS3组Bax和Caspase-3蛋白光密度比值降低(P<0.01)。与AEFLS1组比较，AEFLS2和AEFLS3组Bax和Caspase-3蛋白光密度比值降低(P<0.01)；AEFLS2与AEFLS3组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图4、5。

图5 各组Western-blot检测结果

3 讨 论

既往研究认为心肌细胞死亡之后很难再生。Anversa等[6]研究发现心肌细胞在不断发生凋亡、坏死中再生，心肌细胞的增殖和丢失是维持正常心脏组织自稳态的一部分。成年后，随着年龄的增加心肌细胞逐渐出现老化，其典型表现是心肌细胞丢失增多和增殖减少，增龄造成的心肌细胞丢失由细胞坏死、自噬和凋亡共同作用的结果。生理状态下，以细胞凋亡为主。随着年龄增加，心脏自身生理功能与应激能力下降[7]，人体内自由基清除系统呈退化趋势,造成脂质过氧化和自由基大量积聚，引起心肌细胞凋亡增加，进而导致心肌收缩和舒张功能降低[8-11]。凋亡是由基因控制的程序性细胞死亡方式，提示可通过抑制或减少细胞凋亡来降低心肌细胞丢失率进而延缓心功能的下降。如何最大限度地减少心肌细胞的死亡，在防治老年心脏退行性疾病中具有重要意义，中药的抗衰老作用效果显著。

枸杞的抗衰老作用，历代医书都有记载，其根、茎、芽、果均可入药。早在唐代甄权的《药性本草》中已有关于枸杞叶药用价值的记载。《食疗本草》:“坚筋耐老，除风，补益筋骨，能益人，去虚劳”。有较多文献[12-13]报道枸杞芽具有增强免疫、抗疲劳、耐缺氧等功效。本文应用的宁夏无果枸杞芽经甘肃农业大学重点实验室检测，多种成分远高于枸杞果和普通枸杞芽，其中多酚类物质含量是绿茶的3倍，每百克中含儿茶素14.9 g，硒27 μg、黄酮520 mg、铁3.71 mg、镁1 060 mg、钾669 mg、磷1 570 mg、钙12.2 mg、锌30 μg，生物素16 μg。文献[14]报道黄酮类、多酚类、儿茶素类物质具有清除自由基、抗氧化、延缓衰老等功效。文献[15-16]报道微量元素如锌、硒、铜、铁、磷、钙等在抗衰老机制中发挥重要的作用。李宝玉等[17]研究发现补锌可缓解由缺锌诱导的心肌纤维化对心肌细胞和心肌纤维起到保护作用。因无果枸杞芽中多种微量元素和生物活性物质含量较高，推测其可清除心肌中的自由基、发挥抗氧化、抗心肌细胞凋亡的作用。

因此，本研究观察了无果枸杞芽水提物对衰老心脏的抗氧化作用和对凋亡蛋白表达的影响。结果显示：给予衰老小鼠灌胃无果枸杞芽水提物8周，无果枸杞芽水提物低剂量组小鼠心脏组织SOD及MDA水平无明显变化，中、高剂量的无果枸杞芽水提物可使小鼠心脏组织SOD活性明显提高，高剂量的无果枸杞芽水提物可明显降低小鼠心脏组织MDA水平，提示低剂量的无果枸杞芽水提物其抗氧化能力相对较弱，不能完全清除自由基抵御损伤的作用；中、高剂量的无果枸杞芽水提物其抗氧化成分含量较高，可显著提高衰老小鼠SOD活性，发挥其抗氧化能力，SOD 不断清除心肌组织中的自由基，减少脂质过氧化，降低氧自由基对心肌组织造成的损害，保证心肌组织代谢平衡，维持其功能正常，发挥抗氧化、抗衰老作用。

本研究应用不同剂量的无果枸杞芽水提物干预后，通过免疫组织化学方法和 Wstern-blot 技术观察到衰老心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达变化，结果表明中、高剂量的无果枸杞芽水提物可增加衰老心肌细胞Bcl-2蛋白的表达，降低Bax和Caspase-3蛋白的表达。而且免疫组化和Western-blot检测结果一致，实验结果亦表明中、高剂量的无果枸杞芽水提物使Bcl-2/Bax比值增加，提示无果枸杞芽水提物可改变Bcl-2 蛋白家族Bcl-2家族成员的表达，减少心肌细胞的凋亡。

因此，无果枸杞芽水提物抗心肌细胞凋亡机制可能与提高衰老小鼠心脏组织SOD活性，降低MDA水平，提高机体抗氧化能力，减少了氧自由基在体内的堆积对心肌组织造成的损害，同时无果枸杞芽水提物上调抗凋亡蛋白Bcl-2，下调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白的表达，提高Bcl-2/Bax比值有关，发挥抗心肌细胞凋亡的作用。有关无果枸杞芽水提物中的哪种或哪些成分发挥了作用需要进一步深入研究。

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Effect of Ningxia fruitless lycium sprout extracts on cardiomyocyte antioxidation and apoptotic protein expression in aging mice*

MaXinwei1,LiuLang2#,CaoYikun3,YanQin1,QinYi1,JiaHua1,ZhangLianxiang1,4△

(1.FacultyofHumanAnatomy,HistologyandEmbryology,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;2.GeneralHospital,AffiliatedHopsitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;3.ShizuishangMunicipalFirstPeople′sHospital,Shizuishang,Ningxia753000,China;4.NingxiaKeyLaboratoryofCerebrocranialDiseases,Yinchuan,Ningxia750004,China)

Objective To observe the effect of Ningxia aqueous extracts of fruitless lycium sprout (AEFLS ) on cardiomyocyte antioxidation and apoptosis-related protein expression in aging mice.Methods The natural aging C57BL/6J mice with 13 months old were randomly divided into aged control group,AEFLS low dose group(AEFLS1),AEFLS middle dose group(AEFLS2)and AEFLS high dose group(AEFLS3).The AEFLS1,AEFLS2 and AEFLS3 groups were respectively given with 5,10,20 mg/kg AEFLS gavage,while the aged control group was given with the normal saline gavage,for continuous 8 weeks.The xanthine oxidase assay and thiobarbituric acid method were used for the determination of SOD and MDA in heart tissues.Western-blot and immunohistochemical method were used to detect the expressions of Bcl-2,Bax and Capase-3 in heart tissue.Results Compared with the aged control group,the MDA level in the AEFLS2 and AEFLS3 groups was decreased,while the SOD activity was increased,the difference was statistically significant (P<0.01).The Western-blot result showed that compared with the aged control group,the optical density value of Bcl-2 in the AEFLS2 and AEFLS3 groups was increased,but the optical density values of Bax and Capase-3 were decreased (P<0.01);the immunohistochemical results showed that compared with the aged control group,the immunopositive(IP) expressions of Bcl-2 protein in heart tissues in the AEFLS2 and AEFLS3 groups were increased (P<0.01),while the IP expressions of Bax and Capase-3 were decreased (P<0.01).Conclusion Middle and high doses of AEFLS can increase the antioxidative ability of myocardial tissue,up-regulates the Bcl-2 expression,down-regulates the Bax and Capase-3 expressions and plays anti-cardiomyocyte apoptotic role.

aging;aqueous extract of fruitless lycium sprout;heart;antioxidant;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.004

教育部春晖计划项目(11045)；宁夏医科大学面上项目(NY2014053)。 作者简介：马新伟(1980-),实验师，本科，主要从事衰老和地方中草药抗衰老研究。#：共同第一作者，刘郎(1983-)，在读研究生，主管技师，主要从事心血管疾病的相关研究。△

，E-mail:zhlianxiang@163.com。

R285

A

1671-8348(2017)16-2170-04

2017-01-20

2017-03-24)