老年鼻咽癌患者血浆Ras相关区域家族1A基因、血清转化生长因子-β1及乳铁蛋白的表达及相关性

黄继红 周学军

(海南医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，海南 海口 570102)

老年鼻咽癌患者血浆Ras相关区域家族1A基因、血清转化生长因子-β1及乳铁蛋白的表达及相关性

黄继红 周学军

(海南医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，海南 海口 570102)

目的 探讨血浆Ras相关区域家族(RASSF)1A基因、转化生长因子(TGF)-β1及乳铁蛋白(LTF)在老年鼻咽癌(NPC)患者及其不同临床病理特征中的表达及相关性。方法 NPC患者50例为NPC组，鼻咽炎患者50例为鼻咽炎组，健康志愿者50例为正常对照组。3组采用定量甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)(RQ-MSP)检测RASSF1A基因、血清TGF-β1及LTF的表达情况，并分析相关性。结果 NPC组血浆中RASSF1A、TGF-β1及LTF的表达与鼻咽炎组、正常对照组差异有统计学意义(P<0.05)。NPC组血浆RASSF1A、TGF-β1及LTF水平：Ⅰ期与其他期差异显著(P<0.01)；Ⅲ期与Ⅳa期、Ⅳb期差异有统计学意义(P<0.01)；未分化癌与鳞癌、腺癌差异显著(P<0.01)；无淋巴结转移与有淋巴结转移差异有统计学意义(P<0.01)，颈部和远处淋巴结转移差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RASSF1A、TGF-β1及LTF在老年鼻咽癌患者血清中表达呈上调或下降趋势，与鼻咽癌分期、病理类型及淋巴结转移相关。

鼻咽癌；Ras相关区域家族(RASSF)1A；转化生长因子(TGF)-β1；乳铁蛋白(LTF)

鼻咽癌(NPC)的发病占头颈部恶性肿瘤的50% 以上，占鼻咽部恶性肿瘤的90%，早期NPC规范治疗后5年生存率61.13%～73.19%，晚期仅15.14%～23.16%〔1〕。治疗前后随时可发生颈部淋巴结转移和远处转移，NPC治疗失败是患者死亡的主要原因(占45%～60%)〔2,3〕。如何早诊断早治疗及评定预后，则成为NPC治疗的关键。在人类多种恶性肿瘤和细胞株中，Ras相关区域家族(RASSF)1A基因发生突变的情况很少，但它与Ras的效应基因属于同源基因。有研究表明转染RASSF1A基因可使肺癌细胞株克隆形成率降低，这说明RASSF1A可能抑制肿瘤细胞生长。转化生长因子(TGF)-β1是一种具有多种功能的细胞因子,在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用〔4〕。乳铁蛋白(LTF)是一种分泌性糖蛋白，一些体内外实验都有证实LTF存在多种生物学功能，如参与免疫调节、抗肿瘤等〔5〕。本文探讨老年NPC患者血浆RASSF1A基因、血清TGF-β1及LTF表达及相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年2月至2015年12月海南医学院第一附属医院老年NPC患者50例，入院前均未行化疗或放疗，临床资料完整，其中男31例,女19例，年龄60～85岁,平均(75.6±10.8)岁,均符合《实用肿瘤内科学》鼻咽癌的诊断标准〔2〕。根据中华医学会放射肿瘤治疗学分会2008年制定的临床分期标准〔3〕，健康志愿者50例为正常对照组，其中男26例,女24例，年龄61～81岁,平均(77.6±11.8)岁。鼻咽炎患者50例作为鼻咽炎组，其中男38例,女12例，年龄60～86岁,平均(76.3±9.9)岁。三组年龄、性别均无统计学差异(P>0.05)。均签署知情同意书，经医院伦理委员会通过。

1.2 主要试剂及方法 RASSF1A、TGF-β1及LTF提取试剂盒均购自海南一鼎生物制剂有限公司，按照说明书操作，进行定量甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)(RQ-MSP)法检测。均于消毒条件下，抽取静脉血10 ml，置于消毒试管中，低温离心机离心10 min(1 500 r/min)，提取上清液置入Eppendorf管中，置-80℃冰箱中保存待测。引物设计：由Primer 5.0 引物设计软件设计。RASSF1A基因上游引物：5′-TGCGGGCATGGTTACTGC-3′，下游引物：5′-GAGGGCTTCCTGGACACG-3′，扩增片段长度为197 bp；TGF-β1基因上游引物：5′-TGACCTGTTCCAAAGAGTCCCTG-3′，下游引物：5′-GCAGCTTCCAGCACATATCGACT-3′，其扩增目的片段为486 bp；LTF基因上游引物：5′-CCCAAGCTTGATCCCAGAACCATGAACC-3′，下游引物：5′-AGCGGATCCACCAGTCACAGGGACAT-3′。 三种基因引物均由introvigen公司合成。血浆中DNA的提取：用NANODROP 2000c(Thermo)法参照QIAamp UltraSens Virus Kit说明书检测DNA含量，其完整性通过琼脂糖凝胶电泳法检测。mRNA的提取：可用0.5 ml Trizol(Invitrogen,VSA)，振荡；100 μl氯仿，剧烈振荡，分层静置，12 000 r/min台式离心机离心10 min；取80%上清液，加500 μl异丙醇，沉淀总RNA，12 000 r/min离心机离心5 min，弃上清液，加1 ml 75%冰乙醇洗涤，12 000 r/min离心机离心5 min，弃上清液，空气中干燥30 min，加20～50 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的消毒三蒸水，溶解，低温保存备用。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件进行t检验、线性回归分析。

2 结 果

2.1 3组血清中RASSF1A、TGF-β1及LTF的表达 3组RASSF1A、LTF水平差异无统计学意义(P>0.05),NPC组TGF-β1明显高于鼻咽炎组和正常对照组(P<0.01)。见表1。

表1 3组血清中RASSF1A、TGF-β1及LTF水平的比较

与鼻咽炎组、正常对照组比较：1)P<0.01

2.2 RASSF1A、TGF-β1及LTF的表达与临床病理特征的关系 血清中RASSF1A、TGF-β1及LTF表达：Ⅰ期与其他期差异显著(P<0.01)；Ⅲ期与Ⅳa期、Ⅳb期均有统计学差异(P<0.01)。未分化癌与鳞癌、腺癌差异显著(P<0.01)；无淋巴结转移与有淋巴结转移均有统计学差异(P<0.01)，颈部、远处淋巴结转移有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 RASSF1A、TGF-β1及LTF的表达与NPC患者临床病理特征的关系±s)

1)与Ⅰ期比较，2)与Ⅲ期比较，3)与未分化癌比较，4)与无淋巴结转移比较：均P<0.01；5)与颈部淋巴结转移比较：P<0.05

3 讨 论

NPC在中国华南地区是高发地区，其早期临床表现与鼻咽炎相似，易误诊。早期诊断方面主要包括临床诊断、影像学的检查、EB病毒检查〔6〕，最后才是鼻咽活组织检查，病理组织学诊断是NPC确诊的金标准，但由于经济原因和患者自身的忽视，同时早期病变较小， 所在部位隐蔽，因此，就诊时大部分患者已处于中晚期〔7〕，甚至已经有淋巴结转移，尤其是在老年人群中其病死率较高。虽然RASSF1A的表达与NPC的分期及分类均无显著差异，但随着NPC发生远处转移或是分期延后，其表达都存在下降，提示RASSF1A基因表达下调可能是NPC发病的后期事件〔8,9〕。TGF-β1 广泛存在于正常或癌变组织中,参与细胞增殖、分化、凋亡等过程,使上皮细胞运动和侵袭能力增强,并促进肿瘤血管生成〔10〕，Hu等〔11〕证实TGF-β1 能丰富血管，不仅增加了肿瘤细胞进入血液循环的机会,而且也促进淋巴道转移。细胞角蛋白19可以有效反映肿瘤细胞的活性，是肿瘤诊断、 疗效监控和复发监测的指标之一〔5〕。肿瘤的发生、转移，需要丰富的营养，即再生大量的血管，同时也必须使肿瘤细胞有活性，从而呈现一种强烈的应激状态。本研究发现LFT表达下调，推测在肿瘤的发生、转移及预后都与RASSF1A、TGF-β1及LTF参与相关，并且其在不同时期都发挥重要作用。

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〔2017-01-29修回〕

(编辑 苑云杰)

海南省卫生厅科研项目(No.琼卫2012PT-29)

周学军(1968-)，男，硕士，主任医师，主要从事耳鼻咽喉科疾病研究。

黄继红(1968-)，女，副主任医师，主要从事鼻咽癌肿瘤研究。

R766.3

A

1005-9202(2017)13-3235-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.051