β-肾上腺素受体介导运动训练对老年大鼠心脏缺血预处理效应的影响

吴 芹 宋祥和 郝 玲 王运刚 丁凤云

(盐城卫生职业技术学院，江苏 盐城 224005)

β-肾上腺素受体介导运动训练对老年大鼠心脏缺血预处理效应的影响

吴 芹 宋祥和 郝 玲 王运刚 丁凤云

(盐城卫生职业技术学院，江苏 盐城 224005)

目的 探讨运动训练能否恢复老年大鼠心脏缺血预处理(IP)效应及β-肾上腺素受体(β-AR)的可能作用机制。方法 健康雄性SD成年或老年大鼠，实验分组：成年对照组、老年对照组和老年运动组，每组20只。老年运动组大鼠每天负重5%游泳，5次/w，持续90 d。离体心脏灌流行IP和(或)缺血再灌注(I/R)，使用不同β-肾上腺素受体激动剂或阻滞剂，分离单个心肌细胞，测心肌细胞收缩幅度、存活率等。结果 长期运动训练使老年鼠左心室重量增加显著，左心室/体重比显著增加(P<0.05)。IP显著改善I/R损伤的成年大鼠和长期运动训练老年鼠的心功能，左心室收缩压(LVSP)、±dp/dtmax升高，左心室舒张末压(LVEDP)显著降低；提高了成年鼠和运动训练老年鼠的心肌细胞收缩幅度，但不能提高老年对照鼠心肌细胞收缩幅度；提高了成年鼠和运动训练老年鼠的心肌细胞存活率，但不能提高老年对照鼠心肌细胞存活率。IP时阻断β1-AR，IP不能恢复三组大鼠的心肌细胞收缩幅度；阻断β2-AR，IP能够恢复成年鼠，却不是老年对照鼠和运动训练老年鼠的心肌细胞收缩幅度。结论 IP可部分恢复运动训练老年大鼠的I/R损伤的心功能，其可能机制不仅涉及β1-AR的作用，β2-AR发挥着更为特别的作用。

运动训练；缺血预处理；β-肾上腺素受体

心血管疾病是目前老年人死亡、丧失劳动能力的主要因素。因此，寻求新的药物或干预措施限制梗死心肌面积、阻止细胞凋亡显得尤为重要。研究表明，老年心脏失去了缺血预处理(IP)的保护作用〔1〕。运动训练被认为是弥补老年心脏生理学和解剖学改变的有效措施。本研究观察运动训练能否恢复IP对老年心脏的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 正常健康SD大鼠，成年鼠6月龄，老年鼠24月龄，雌雄不拘，清洁级，购自徐州医学院实验动物中心。实验设计经盐城卫生职业技术学院实验动物伦理委员会批准。老年大鼠分为老年对照组和老年运动组，老年运动组每天负重5%游泳，5次/w，持续90 d。各组常规饲养，90 d后实验。

1.2 离体心脏灌流和心肌细胞分离 每组随机取10只大鼠称重，腹腔注射5 000 IU/kg肝素，约10 min后，颈椎脱臼处死，迅速开胸取心，参照文献〔2〕把主动脉插入Langendorff灌注架上，用线结扎固定。经房室瓣插入带球囊的心导管抵左心室，通过MacLab生物信号采集软件检测左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室内压上升和下降的最大变化速率(±dp/dtmax)。稳定20 min后，随机分组：①对照组：稳定后，持续灌注80 min，不作处理；②缺血再灌注(I/R)组：稳定后，持续灌注20 min，不作处理；③IP组：稳定后，停灌5 min，复灌5 min，循环4次；④异丙肾上腺素(ISO)处理组：稳定后，含10 nmol/L ISO的K-H液灌 5 min，洗脱5 min；⑤IP+CGP20712A组(IP+CGP组)：心脏IP前5 min起，整个过程均使用300 nmol/L的CGP20712A；⑥IP+ICI118551组(IP+ICI组)：心脏IP前5 min起，整个过程均使用55 nmol/L的ICI118551。各组按上述方法处理后，均行关泵停灌30 min，再用100%O2饱和的K-H液复灌30 min。然后，酶法分离得单个心室肌细胞，按约2×104cells/well接种于无血清高糖DMEM(Hyclone公司)，置CO2培养箱(德国Heraeus公司)中孵育2 h测定心肌细胞收缩幅度。

1.3 心脏重量测定 另每组10只大鼠，颈椎脱臼处死后，立即取心脏置滤纸上，吸干血迹。称取心脏重量(HW)，剪下左心室并称重(LVW)。计算左室质量指数=LVW/体重(BW)。

1.4 心肌细胞收缩幅度测定 收集心肌细胞置于收缩功能分析装置的细胞浴槽内，用蠕动泵将含有2.0 mmol/L钙和100 nmol/L浓度的ISO(Sigma公司) 的K-H液，循环至细胞槽内，然后用刺激器对细胞进行刺激(0.5 Hz，37℃)。用心肌细胞收缩软件分析，得到心肌细胞收缩幅度的变化〔3〕。

1.5 心肌细胞存活率的测定 在镜下计数一定数量的心肌细胞，其中长杆状细胞占总细胞的比率作为心肌细胞的存活率，用百分比(%)表示。每一组选5个视野，共计数200 个细胞。此步骤由一对实验不知情者进行。

1.6 统计学方法 使用GraphPad Prism4.0 分析软件，两组间比较用t检验，方差不齐用校正t检验；多组间的比较采用方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1 年龄和运动训练对大鼠BW和LVW的影响 老年大鼠BW显著增加，与成年鼠相比，HW、LVW〔老年对照组(2.05±0.48)mg/g、成年对照组(1.94±0.97)mg/g、老年运动组(2.27±0.87)mg/g〕均显著增加(P<0.05)。老年运动鼠与成年鼠相比，年龄对BW、HW、LVW影响仍存在(P<0.05)。长期运动训练使老年鼠BW增加没有对照老年鼠明显(P>0.05)，但HW、LVW增加显著(P<0.05)。见表1。

表1 各组BW与LVW的比较

与成年对照组比较：1)P<0.05；与老年对照组比较：2)P<0.05

2.2 不同灌注条件下各组血流动力学参数的比较 正常灌注条件下，三组血流动力学参数无显著差异(P>0.05)。I/R使各组大鼠心功能均受损，表现为LVSP、±dp/dtmax降低，LVEDP升高(均P<0.05)。老年对照组损伤尤为严重，与正常灌注相比，I/R后LVSP、±dp/dtmax分别下降了53.49%、50.98%和58.44%，而LVEDP却增加了4.54倍。长期运动训练对保存老年鼠抗I/R损伤能力有一定作用，仅LVSP有统计学差异(P<0.05)。IP显著改善I/R损伤的成年大鼠和长期运动训练老年鼠的心功能，LVSP、±dp/dtmax升高，LVEDP显著降低(P<0.05)。老年对照组虽然经历了IP，却不能改善I/R损伤后的心功能。老年对照组经历IP后，LVSP、±dp/dtmax分别恢复了60.46%、64.28%和58.68%，LVEDP是正常灌注条件下的4.34倍。见表2。

表2 各组不同灌注条件下的血流动力学参数变化±s)

与正常灌注比较：1)P<0.05；与I/R比较：2)P<0.05；与成年对照组比较：3)P<0.05；与老年对照组比较：4)P<0.05，下表同

2.3 不同灌注条件下各组大鼠单个心肌收缩幅度比较 I/R条件下，与成年鼠相比，老年鼠心肌细胞收缩幅度显著降低(P<0.05)。但长期运动训练老年鼠心肌细胞收缩幅度与成年鼠相比没有显著差异(P>0.05)。IP显著提高了成年鼠和运动训练老年鼠的心肌细胞收缩幅度，但不能提高老年对照鼠心肌细胞收缩幅度。正常灌注条件下，三组大鼠心肌细胞收缩幅度无显著差异(P>0.05)。见表3。

2.4 不同灌注条件下各组大鼠心肌细胞存活率的变化 与成年鼠相比，I/R条件下，老年鼠心肌细胞存活率显著降低〔(41.78±9.64)% vs (52.47±10.52)%,P<0.05〕。但长期运动训练老年鼠心肌细胞存活率与成年鼠相比没有显著差异〔(48.68±9.67)%，P>0.05〕。IP显著提高了成年鼠和运动训练老年鼠的心肌细胞存活率，但不能提高老年对照鼠心肌细胞存活率〔(77.02±13.05)%、(46.82±8.41)%、(70.76±8.36)%〕。

2.5 激活或阻断β-肾上腺素受体(β-AR)后各组大鼠心肌细胞收缩幅度的变化 ISO模拟IP，激活β-AR后，无论是成年鼠、老年对照鼠还是运动训练老年鼠，心肌细胞收缩幅度均显著高于I/R组(P<0.05)，与正常灌注相比无统计学差异(P>0.05)。IP时阻断了β1-AR，IP不仅不能恢复老年对照鼠的心肌细胞收缩幅度，也不能恢复成年鼠和运动训练老年鼠的心肌细胞收缩幅度。IP时阻断了β2-AR，IP恢复了成年鼠的心肌细胞收缩幅度，却不能恢复老年对照鼠和运动训练老年鼠的心肌细胞收缩幅度。见表3。

表3 激动或阻断β-AR后各组大鼠在不同灌注条件下心肌细胞收缩幅度比较±s，%)

3 讨 论

IR是心脏最有力的抗I/R损伤的内源性保护机制，但随着年龄的增加，这种作用逐渐失去。其中原因涉及多种介质，如：腺苷受体、去甲肾上腺素、缓激肽等。Abete等〔3〕发现，IP降低了成年大鼠和训练老年大鼠心脏缺血后功能失调，与增加了去肾上腺素释放有关，运动训练可以通过增加去甲肾上腺素释放恢复老年大鼠心脏预处理效应。Corbi等〔4，5〕发现，β-肾上腺素刺激或运动训练均能降低心率、心肌收缩力、心输出量和射血分数。在高强度运动情况下，年老导致心率下降与尽管循环水平儿茶酚胺水平升高，但β-肾上腺素反应性降低有关。本实验研究发现IP可部分恢复运动训练老年大鼠的I/R损伤的心功能，其可能机制不仅涉及β1-AR的作用，β2-AR发挥着更为特别的作用。

早在1993年，Böhm等〔6〕就研究发现，与成年大鼠相比，老年大鼠心肌膜上ISO激活的AC活性下降，伴随着15%的百日咳毒素结合位点增加，72%的免疫测定的Giα蛋白增加。中等强度的跑步训练降低了成年和老年大鼠心肌膜上30%～35%的Giα蛋白，但是仅提高了老年大鼠心肌膜上的ISO刺激的AC活性，还提高成年大鼠基础的、Gpp(NH)p(一种真核细胞有力的AC激活剂)及ISO刺激的AC活性。本课题组先前研究发现〔2〕，短暂使用非选择性β-ARs激动剂ISO可模拟IP，0.02 μmol/L ISO显著降低再灌时冠脉流出液中肌酸激酶(CK)的释放，保存了冠脉流量(MCF)和心率血压乘积(RPP)。普萘洛尔(1 μmol/L)或阿替洛尔(10 μmol/L)，一种β1-AR阻断剂，而不是高选择性β2-AR阻断剂ICI 118551(2 μmol/L)，完全抑制了ISO预处理的作用。这些结果表明，β-ARs介导大鼠心脏IP效应，β1-AR起主要作用。本研究发现，IP时阻断了β1-AR，IP不仅不能恢复老年对照鼠的心肌细胞收缩幅度，也不能恢复成年鼠和运动训练老年鼠的心肌细胞收缩幅度，说明β1-AR在IP部分恢复运动训练老年大鼠的I/R损伤的心功能中发挥重要作用。Leosco等〔7〕发现，运动训练和β肾上腺素阻断剂能够改善老年心脏的β-AR信号，促进β-AR反映和相应的左心室正性肌力储备。Tong 等〔8〕以小鼠为模型，发现ISO在小鼠心脏也能诱导心脏保护作用，且被PTX(Gi抑制剂)阻断；但在β2-AR基因敲除小鼠却没有作用，认为IP通过β2-AR-Gi激活介导的。本课题组先前研究发现，自主运动训练依赖β2-AR改变保护心功能〔9〕。本研究发现，β2-AR在IP部分恢复运动训练老年大鼠的I/R损伤的心功能中发挥着更为特别的作用。

Ferrara等〔10〕综述，分析相关机制发现，β2-AR激活时同时与Gs和Gi耦联，Gi通路对Gs通路信号向细胞内的扩散起屏蔽作用，从而使β2-AR激活出现不同于β1-AR激活的功能特性。而且，Böhm等〔6〕还发现运动训练或年老对β-AR数量没有作用，提高Giα表达可能是导致老年心肌cAMP 形成降低的一个机制。在没有β-AR改变的前提下，Giα可能是生理病理状态下心脏AC的调节器。当然，在2011年，Calvert等〔11,12〕研究发现，运动训练保护I/R损伤的心肌是通过刺激β3-AR，提高NO代谢物的储备实现的。综上所述，IP恢复运动训练老年大鼠的I/R损伤的相关机制还有待进一步研究。

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10 Ferrara N，Komici K,Corbi G.β-adrenergic receptor responsivenesss in aging heart and clinical implications〔J〕.Clin Translat Physiol，2014；4(396)：1-10.

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〔2015-12-15修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

盐城市医学科技发展计划项目(No.YK2011121)

丁凤云(1963-)，女，教授，主要从事心血管功能调控研究。

吴 芹(1974-)，女，硕士，副教授，主要从事心血管功能调控研究。

R331

A

1005-9202(2017)13-3164-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.019