红景天、红景天苷对小鼠骨骼肌质量的调控作用及机制

于 亮 周 越 陈晓萍

(北京体育大学运动人体科学学院，北京 100084)

红景天、红景天苷对小鼠骨骼肌质量的调控作用及机制

于 亮 周 越 陈晓萍1

(北京体育大学运动人体科学学院，北京 100084)

目的 探讨红景天、红景天苷对小鼠下肢骨骼肌质量和慢肌、快肌表达的影响及作用机制。方法 40只小鼠经过预实验筛选后，选取其中30只分为对照组、红景天组和红景天苷组。检测比目鱼肌、跖肌的骨骼肌湿重及Troponin I-SS(TnI-SS)、Troponin I-FS(TnI-FS)、Akt、p-Akt(Ser473)、TβR-Ⅱ的蛋白表达，Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表达，分析调控机制。结果 各组小鼠体重未见明显差异，肌湿重略有增加，差异无统计学意义。与对照组相比，红景天苷组小鼠比目鱼肌和跖肌中TnI-SS和TnI-FS表达增加，使骨骼肌质量得以提升。红景天苷可有效提升Akt及其磷酸化水平，抑制TβR-Ⅱ的表达，抑制Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表达。结论 红景天苷可促进小鼠骨骼肌TnI-SS和TnI-FS表达，从而使骨骼肌质量得以提升；促进蛋白质合成关键因子Akt及其磷酸化的表达，抑制TβR-Ⅱ表达，可能为调控小鼠骨骼肌质量的机制。

骨骼肌；红景天；红景天苷；骨骼肌质量；肌纤维类型

去负荷肌萎缩是在运动损伤后的长期制动、卧床，以及航天飞行过程中失重等去负荷干预情况下，机体在维持姿势或进行活动时无需对抗重力作用出现的肌肉体积、横截面积明显缩小，力量、收缩性能下降等肌肉失用性状态，其发生、发展影响到人体机能的保持与恢复效率，影响到运动员复训或康复期间骨骼肌力量的恢复等竞技体育和全民健身关键问题。红景天具有抗低氧、抗疲劳、抗应激等多种功效，其提纯所得出的主要成分红景天苷，在各领域可能具有更为广阔的应用前景。对上述两种中成药在骨骼肌质量和肌纤维类型等方面进行系统研究后发现，红景天、红景天苷补充可促使慢肌纤维表达增加，此外还可适当增加快肌纤维表达〔1〕，提示可能具有促使骨骼肌蛋白质合成的机制存在。PI3K/Akt信号通路是骨骼肌内促使蛋白质合成的主要途径，其中关键因子丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)为PI3K的下游信号分子，能介导多种生物学效应，可抑制TGF-β/Smad这一促使骨骼肌蛋白质降解的主要通路的表达〔2,3〕；而TGF-β通路主要由TGF-β受体(TβR)及受体底物Smad蛋白家族信号分子组成〔4〕。因此，研究Akt和TβR-Ⅱ可进一步明确骨骼肌蛋白质合成和(或)降解的机制。本研究采用C57BL/6小鼠28 d红景天及红景天苷灌胃研究相应的调控作用，分析关键因子表达与骨骼肌体积、肌纤维类型表达程度的关系，从调节蛋白质代谢的角度探究其防治去负荷肌萎缩的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 8周龄C57BL/6雄性小鼠40只，6只/笼饲养，自由饮食、饮水，常规饲料，温度(21±2)℃，相对湿度45%～55%，昼夜明暗交替为12 h光照/12 h黑暗。将所有小鼠称重、标记号码后，每天放入跑台以10 m/min运动15 min，预适应3 d，综合体重和运动能力情况，筛选其中30只小鼠，并分为生理盐水灌胃的对照组(Con)、红景天溶液灌胃的红景天组(Rho)和红景天苷溶液灌胃的红景天苷组(Sal)，每组10只。

1.2 实验方案 分别向红景天组和红景天苷组小鼠每天每只小鼠灌0.1 ml药物。红景天采用浅褐色干燥颗粒“红益胶囊”溶解；红景天苷用高效液相色谱检测其纯度高达98%，为白色粉末。灌胃剂量以小鼠体重为标准，红景天按200 mg/kg的标准灌胃，红景天苷按50 mg/kg的标准灌胃。

1.3 取材与检测方法

1.3.1 取材 按照实验设计，在实验前后称量小鼠体重(g)。在28 d灌胃结束后次日晨，将小鼠颈椎脱臼处死，以提取RNA的标准分别取对照组、红景天组和红景天苷组的小鼠双侧比目鱼肌和跖肌，称量湿肌重量(mg)后迅速置于冻存管投入液氮内保存。

1.3.2 主要试剂、仪器 Akt、p-Akt、TβR-Ⅱ抗体，Cell Signaling公司。β-actin抗体(内参)，Santa Cruz公司。sc-47778、Atrogin-1、MuRF-1、18S引物，北京奥科鼎盛生物科技有限公司。SYBR®Green PCR Master Mix，Applied Biosystems公司，美国。P/N：4367659。电转仪、电泳槽等，美国Bio-Rad。

1.3.3 Western印迹 分离胶浓度：TβR-Ⅱ为8%；Akt和p-Akt为10%；TnI-SS和TnI-FS为12%。积层胶浓度：均为5%。电泳完成后用丽春红对NC膜进行预染，洗膜后1%TBST配脱脂奶粉成5%脱脂牛奶封闭。一抗：TnI-SS、TnI-FS用5%脱脂牛奶配制，浓度为1∶1 000；Akt、p-Akt和TβR-Ⅱ用5%BSA配制，浓度为1∶500。Beta-actin用5%脱脂牛奶配制，浓度为1∶3 000。摇床洗膜后加入二抗。二抗：用5%脱脂牛奶配制，Akt、p-Akt和TβR-Ⅱ浓度为1∶500，TnI-SS、TnI-FS浓度为1∶1 000，Beta-actin浓度为1∶2 000。摇床洗膜后暗室内曝光显影。

1.3.4 Real time PCR 取实时荧光定量PCR用管，将注射用水、上游引物、下游引物、模板和SYBR Green酶用移液器混入管两端，混匀后每孔加15 μl样本，短暂离心后放入实时荧光定量PCR仪中。反应体系50 μl分别为注射用水21 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、cDNA 2 μl、SYBR Green 25 μl。每个样本重复3次，采用相对Ct值定量分析(△△Ct)。引物设计序列：Atrogin-1：上游：5′-GGTCCAAAGAGTCGGCAAGTC-3′，下游：5′-CCATCCGATACACCCACATG-3′；MuRF-1：上游：5′-CAACCTGTGCCGCAAGTG-3′，下游：5′-CAACCTCGTGCCTACAAGATG-3′；18S：上游：5′-GCACACATACATGCACGAA-3′，下游：5′-AAAATGAAAGCCCATAGCC-3′。

1.4 数据处理与分析 用IPP6.0软件处理条带，进行灰度分析。运用SPSS16.0软件，方差齐性检验采用Levene方法，单因素方差分析(One-way ANOVA)处理数据。

2 结 果

2.1 小鼠体重及肌湿重变化 对照组、红景天组和红景天苷组运动时间分别为(145.72±9.89)min、(143.79±15.51)min和(145.79±13.94)min，3组间无统计学意义(P>0.05)；体重分别为(20.92±0.37)g、(20.65±0.25)g和(20.58±0.72)g，3组无显著差异(P>0.05)。28 d灌胃后，体重均出现上升状况，3组分别为(25.36±0.59)g、(25.44±0.41)g、(25.65±0.61)g;3组分别上升(4.44±0.53)g、(4.79±0.36)g和(5.07±0.75)g，无显著差异(P>0.05)。天平称量肌肉湿重发现，与对照组相比，红景天组和红景天苷组的比目鱼肌和跖肌重量平均增加1～2 mg，但差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 不同类型肌纤维TnI-SS和TnI-FS的表达 比目鱼肌为典型的慢肌纤维，其中TnI-SS的表达量较多，而跖肌作为典型的快肌纤维，TnI-SS的表达较少难以检测。通过检测小鼠典型的慢肌纤维(比目鱼肌)和典型的快肌纤维(跖肌)中TnIss表达，发现比目鱼肌中红景天和红景天苷灌胃的小鼠TnI-SS表达量明显升高(分别为6.21±0.23，6.14±0.36)，与对照组(设为1)相比差异显著(P<0.01)；跖肌中未检测到TnI-SS表达，见图1。由于骨骼肌快肌纤维百分比较高，因此无论是比目鱼肌还是跖肌中均检测到快肌肌钙蛋白(TnI-FS)表达。在跖肌中各组的TnI-FS表达未见显著性差异(对照组、红景天组、红景天苷组分别为1，1.14±0.27、1.02±0.21)(P>0.05)；而比目鱼肌中红景天组和红景天苷组的TnI-FS表达(1.23±0.13，1.28±0.16)与对照组(设为1)相比均具有显著性差异(P<0.05)，见图2。

1～3:对照组、红景天组、红景天苷组，下图同图1 比目鱼肌和跖肌TnI-SS蛋白表达

图2 比目鱼肌和跖肌TnI-FS蛋白表达

2.3 比目鱼肌Akt、p-Akt及TβR-Ⅱ的表达 与对照组(1)相比，红景天苷组Akt表达水平(1.21±0.06)明显升高(P<0.05)，红景天组表达水平下降(0.72±0.05)p-Akt呈现阶梯式上升，即红景天组表达水平(1.74±0.12)高于对照组(1)(P<0.05)，红景天苷组表达水平(0.21±0.21)高于对照组和红景天组(P<0.05)。与对照组(1)相比，红景天组(0.38±0.02)和红景天苷组(0.83±0.02)的TβR-Ⅱ表达水平明显下降(P<0.01)，见图3，图4。

图3 比目鱼肌Akt和p-Akt蛋白表达

图4 比目鱼肌TβR-Ⅱ蛋白表达

2.4 比目鱼肌Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表达 4 w红景天苷灌胃后比目鱼肌中Atrogin-1(0.78±0.07)和MuRF-1(0.9±0.09)基因表达水平较对照组(1±0.09，1±0.20)下降，Atrogin-1 mRNA表达下降具有显著性差异(P<0.05)，MuRF-1的下降未见显著性差异(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 红景天苷对骨骼肌质量和肌纤维类型的调控 红景天是多年生草本或亚灌木植物，广泛分布在欧亚大陆的山地地区，多年以来作为祖国传统医药受到了广泛关注，主要成分为红景天苷和甙元酪醇、络塞维等，具有改善机体免疫力，调节物质代谢，调节神经系统等药理作用，与运动相关的主要作用是抗疲劳、抗缺氧。作为提纯获取的主要成分，红景天苷在调节代谢方面的作用要强于红景天，可促使糖原合成增加、脂肪代谢改善。前期针对红景天、红景天苷对骨骼肌作用的研究结果表明，在结合运动的情况下二者促使MHC-Ⅰ的mRNA表达增加，MHC-Ⅱb的mRNA表达减少，同时TnI-SS蛋白表达量增加，即具有促进骨骼肌慢肌纤维增加的作用，但与对照组相比红景天和红景天苷补充后体重及肌肉湿重未出现明显变化，分析可能为药物灌胃后的小鼠运动能力增强，运动时间和运动距离增加，消耗了更多脂肪所致〔5〕。本研究表明运动是促使肌肉湿重下降的因素之一。

肌纤维类型主要按照肌球蛋白重链亚型(MHC)分为Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱd/x型和Ⅱb型。从能量代谢的角度看，由于快肌MHC亚型消耗ATP速度比慢肌MHC亚型快，因此可以基于MHC亚型进行系统分类〔6〕。横桥的循环速度是由MHC亚型决定的，MHC-Ⅰ最慢，MHC-Ⅱa型居中，MHC-Ⅱd/x为混合型，MHC-Ⅱb型最快〔7〕。而肌钙蛋白亚单位Ⅰ(TnI)是钙离子调节横纹肌收缩过程中关键的蛋白，分子量约为18.5 kD，其异构体的区别直接导致肌纤维功能和状态的差异。慢肌肌钙蛋白(TnI-SS)和快肌肌钙蛋白(TnI-FS)分别表示慢肌纤维和快肌纤维，与MHC-I和MHC-Ⅱ相对应〔8,9〕。本实验发现4 w红景天及红景天苷灌胃对慢肌纤维比目鱼肌的影响如前期研究，会促使TnI-SS的表达增加。TnI-FS的表达量与前期结合运动的小鼠有所区别，无论在比目鱼肌中还是在跖肌中均会促使TnI-FS的表达不断增加，表明可适当地增加快肌部分，使骨骼肌质量得以提升。

骨骼肌的糖转运可由PI3K/Akt和AMPK两条信号通路激活完成。AMPK是细胞内的能量感受器，在调节糖代谢和脂代谢过程中具有重要作用〔10〕。有研究采用不同剂量的红景天苷对大鼠进行连续12 d灌胃，发现红景天苷可显著提高大鼠运动耐力〔11〕，分析红景天苷可能增加细胞能量利用率，促使AMP含量降低，保证骨骼肌细胞能量平衡，骨骼肌的应激能力得到改善〔12〕。有文献报道，Akt可调控萎缩因子的变化还与运动过程中能量代谢“开关”AMPK相关〔13〕，如果动物不进行运动，是否会启动PI3K/Akt通路，从而完成对骨骼肌质量的调控尚未得知，因此我们检测了关键信号Akt蛋白表达及其磷酸化的水平。

3.2 红景天苷调控Akt磷酸化影响骨骼肌质量 Akt是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，可通过特定的激酶磷酸化，其活性由磷酸化位点特异性的磷酸酯酶控制，在PIP3去磷酸化后活性降低，降低的程度受Akt调控。Akt具有促进细胞增殖、分化等多种功能〔14〕。在Akt高表达的情况下，可抑制TGF-β家族的肌肉生长抑素(MSTN)的活性〔15〕，从而促使蛋白质合成，在骨骼肌组织表现为肌纤维体积增加。本研究提示在骨骼肌组织中红景天具有促使骨骼肌质量和体积增加的效用，在各种成分中红景天苷起主要作用。

现已明确，PI3K/Akt信号通路和TGF-β/Smad信号通路互相抑制，维持组织稳态。TGF-β家族中的MSTN会诱导关键因子Smad2和Smad3的激活和磷酸化，抑制Akt/mTOR/p70S6K通路，从而使肌管细胞分化后，引起肌纤维直径减小〔16〕。而TGF-β通路主要由TβR及受体底物Smad蛋白家族信号分子组成。活化的配体与TGF-β的Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)结合，再与ALK-1或TβR-I/ALK-5(TGF-β的I型受体)结合，该通路通过调节细胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡而在生物整体及各种器官的发育过程中起重要的作用。在肌萎缩大鼠模型中TβR-Ⅱ及Smad表达均出现不同程度的增加〔17，18〕。TβR-Ⅱ表达高低，是影响TGF-β1-TβR-Ⅱ-Smad3信号通路发挥作用的关键因素，直接影响下游基因的活化。由于Akt可以促进蛋白质合成及防止骨骼肌萎缩的关键因子MuRF-1和Atrogin-1的转录上调，对叉头框蛋白O(FoxO)转录因子家族起抑制作用〔19〕，所以，当Akt磷酸化后FoxO出核，MuRF-1和Atrogin-1上调机制被阻断。MuRF-1和Atrogin-1通过特定的泛素蛋白质底物，引发蛋白酶体降解。MuRF-1的作用底物包括肌节内的Myosin及MHC，因此可通过抑制MuRF-1激活，在萎缩的条件下防止Myosin降解。Akt通过mTOR/p70S6K促进蛋白质合成，通过磷酸化和失活Ask1、Bad、Bax和FoxO3a等凋亡因子提高细胞的生存率。红景天苷在抑制TβR-Ⅱ表达的同时，抑制了MuRF-1和Atrogin-1的mRNA的表达，对于Atrogin-1的mRNA具有明显抑制效应(P<0.05)，从另一侧面证实了红景天苷提升骨骼肌质量的作用。

总之，红景天苷灌胃可促进小鼠骨骼肌TnI-SS和TnI-FS表达，从而使骨骼肌质量得以提升，其主要机制可能为红景天苷促进骨骼肌蛋白质合成关键因子Akt及其磷酸化的表达，阻断了MuRF-1和Atrogin-1上调途径，抑制TβR-Ⅱ表达，使TGF-β家族下游的配体无法有效结合，致使Smad表达下降所致。对去负荷肌萎缩的治疗和预防具有一定的意义，需进行相关信号通路激活、阻断等深入研究。

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〔2017-01-30修回〕

(编辑 李相军)

Regulation and mechanism of rhodiola, salidroside on skeletal muscle mass

YU Liang, ZHOU Yue, CHEN Xiao-Ping.

Sport Science College, Beijing Sport University, Beijing 100084, China

Objective To explore the regulation and mechanism rhodiola, salidroside on mouse skeletal muscle mass, slow twitch and fast twitch.Methods 30 C57BL/6 mice were chosen from 40 mice after preliminary experiment and divided into control, rhodiola and salidroside groups. Mice were intragastric administrated for 4 weeks. Skeletal muscle weight, Troponin I-SS (TnI-SS), Troponin I-FS (TnI-FS), Akt, p-Akt(Ser473) and TβR-Ⅱ of soleus and plantaris were measured.Results There were no significant differences in weight and muscle weight of skeletal muscle among three groups, muscle wet weight increased slightly, but there was no statistically significant differences. Compared to the control group, TnI SS, TnI FS of soleus expression were increased, the skeletal muscle mass improved in rhodiola and salidroside groups. Salidroside could effectively enhance the level of Akt and p-Akt (Ser473), inhibit the expression of TβR-Ⅱ, Atrogin-1 and MuRF-1 mRNA.Conclusions Four weeks of salidroside intragastric gavage could increase the slow and fast fiber express, improve skeletal muscle mass. Promotion expression of the protein synthesis key factors Akt and its phosphorylation, inhibition TβR-Ⅱ expression, might be the mechanism for regulating the skeletal muscle mass in mice.

Skeletal muscle; Rhodiola; Salidroside; Skeletal muscle mass; Muscle fiber type

国家自然科学基金项目(31500964)；国家体育总局全民健身课题(2015B046)；中央高校基本科研业务费专项资金资助；北京体育大学自主科研项目(2016RB018；2016YB047)

陈晓萍(1965-)，女，博士，研究员，主要从事失重条件下骨骼肌形态功能的调控研究。

于 亮(1981-)，男，博士，副教授，主要从事运动对骨骼肌形态和功能的影响研究。

G804.23

A

1005-9202(2017)13-3129-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.004

1 中国航天员科研训练中心