离子色谱法测定水产加工制品中多聚磷酸盐含量

常家琪，梅光明，张小军，韩程程，高学慧,3

（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；3.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022）

离子色谱法测定水产加工制品中多聚磷酸盐含量

常家琪1,2，梅光明2，张小军2，韩程程1,2，高学慧2,3

（1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；3.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022）

建立了水产品中多聚磷酸盐的离子色谱测定方法。对萃取温度、提取液pH值以及色谱条件进行优化。结果表明，5 种多聚磷酸盐（磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、三偏磷酸盐及六偏磷酸盐）分别在 0.1～100、0.2～50、0.1～60、0.3～40、0.5～100 mg/L质量浓度范围内组分含量与峰面积呈线性相关，相关系数为0.999 2～0.999 8，检出限为0.5～3.0 mg/kg；定量限为2.0～5.0 mg/kg。水产加工制品中5种多聚磷酸盐不同浓度加标水平（50、100、200 μg/kg）时，回收率为80.2～100.3%，相对标准偏差（RSDs）小于9%。该方法简便、快速、选择性好、准确度高、重现性好，可作为测定水产加工制品中多聚磷酸盐含量的一种理想方法。

离子色谱法；多聚磷酸盐；水产品；测定方法

多聚磷酸盐是世界各国应用最多的食品添加剂之一，作为重要的食品配料和功能添加剂广泛应用于水果、蔬菜、调味料、水产品等各类食品的加工过程中，对食品品质的改良起着重要作用[1]。多聚磷酸盐类主要以正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、三偏磷酸盐以及六偏磷酸盐等多种形式存在。在水产品加工过程中，它能够提高水产品的保水性，增强其水分的稳定性，减少营养成分的损失，在不影响水产品品质的前提下降低成本，是一种高效水产品添加剂[2-4]。但磷酸盐摄入量过多时会引发人体内钙、磷比例失调，导致发育迟缓、骨质疏松、肝脏功能受损[5-6]，其降解产物增大心血管疾病的患病率[7]等。因此许多国家对水品中多聚磷酸盐的使用也是有着明确的规定[8]。其中我国国家标准GB2760-2014规定冷冻水产品和冷冻鱼糜制品中以磷酸根计量，磷酸盐含量不得超过5.0 g/kg[9]，欧盟要求水产品中多聚磷酸盐的含量不得超过0.5 g/kg[22]，美国规定最终产品中磷酸盐的残留量不得超过0.5%（质量分数）。目前水产品中多聚磷酸盐含量测定的方法主要有分光光度法[10-12]、薄层层析色谱法[13]、核磁共振法[14]、离子色谱法[15-21]等。其中分光光度法不能确定多聚磷酸盐的种类；薄层层析色谱法灵敏度低且不能准确定量，不能满足检测需求；核磁共振法均因操作过程繁琐、对检测人员要求较高等原因，不能广泛地应用到食品分析中[22]。我国现行国家标准GB5009.256-2016规定食品中多聚磷酸盐的测定采用离子色谱法[23]。本实验采用离子色谱法对不同形态的多聚磷酸盐同时进行进行测定，优化了样品前处理条件和色谱条件，取得了满意的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

试验使用的实际测定样品（墨鱼丸、虾丸、日本黄姑鱼丸）均购于浙江舟山水产品零售市场，经高速组织捣碎机均匀捣碎后作为待检样品。

1.1.2 试剂

氢氧化钠、氢氧化钾均分析纯，甲醇为色谱纯，实验用水为GB/T 6682-2008规定的一级水。

磷酸钠标准溶液（1 000 mg/L），焦磷酸钠标准溶液（1 000 mg/L），六偏磷酸钠标准溶液，美国sigmaaldrich公司；三偏磷酸钠标准品，纯度≥98%，济南光辉化工有限公司；三聚磷酸钠标准品，纯度≥98%，吴江市今朝化工科技有限公司。

10 mmol/L NaoH溶液：准确称取0.4 g氢氧化钠，溶于水并稀释定容至1 000 mL。50 mmol/L NaoH溶液：准确称取2.0 g氢氧化钠，溶于水并稀释定容至1 000 mL。

磷酸根、焦磷酸根和六偏磷酸根标准中间液（100 mg/L）：分别准确吸取磷酸钠标准溶液17.3 mL、焦磷酸钠标准溶液15.3 mL和六偏磷酸钠标准溶液12.9 mL于100 mL的容量瓶中，用10 mmol/L氢氧化钠溶液定容至刻度线，4℃冷藏保存备用。

三偏磷酸根和三聚磷酸根标准贮备液（1 000 mg/L）：分别准确称取干燥4 h（80℃）后的三偏磷酸钠标准品0.132 g，三聚磷酸钠标准品0.148 g，用10 mmol/L氢氧化钠溶液稀释至100 mL，4℃冷藏保存备用。

1.2 仪器和设备

ICS-3000离子色谱仪（配电导检测器），美国Dionex公司；IKA T18基本型组织捣碎机，德国IKA公司；AL204型电子天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；SL-502N型台式天平，上海华岩设备仪器有限公司；Centrifuge 5810台式高速离心机，德国Eppendorf公司；超声波清洗机，杭州法兰特超声波科技有限公司；漩涡振荡器，德国IKA公司；OnGuardⅡRP小柱（1.0 mL），美国Dionex公司，使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水通过，静置活化30 min。

1.3试验方法

1.3.1 样品提取

称取2.500 g（精确至0.001 g）待测水产制品样品置于100 mL离心管中，加50 mmol/L氢氧化钠溶液混匀，继续加该溶液至100 mL刻度线处，置于涡旋振荡器混合均匀后，于80℃超声提取30 min，间隔5 min振荡一次直至完全分散开来，冷却至室温，溶液经滤纸过滤，取部分溶液于4℃下8 000 r/min离心10 min，取上清液备用。取上清液约15 mL，依次通过0.45 μm水相滤膜、OnGuardⅡRP小柱后，弃去前面3 mL，收集后面洗脱液上离子色谱仪测定。

空白试验除不加待测样品外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量，进行平行操作的试验。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：分离柱为Dionex Ionpac AS11-HC（4 mm×250 mm），保护柱为Ionpac AG11-HC型（4 mm×50 mm）；淋洗液：氢氧化钾溶液，梯度洗脱时间及浓度见表1，流速：1.0 mL/min；检测器：电导检测器；柱温：30℃；进样量：100 μL；运行时间：30 min。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase

1.3.3 标准曲线

分别吸取磷酸根标准中间液、焦磷酸根标准中间液、三偏磷酸根标准贮备液、三聚磷酸根、六偏磷酸根标准贮备液适量，配制成不同浓度的混合标准溶液进行上机分析，以不同的磷酸根离子质量浓度（mg/L）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程。

1.3.4 回收率和精密度

称取2.500 g待测样品，分别向其中加入一定量的不同浓度梯度（高、中、低）的混合标准溶液，涡旋混匀放置30 min，按上述方法进行前处理和上机分析。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 萃取温度

本实验考察了前处理过程中超声波萃取温度的影响。将待测样品分别置于40℃、80℃和100℃不同温度条件下进行实验，结果发现，80℃时，相同加标浓度下的5种多聚磷酸根的测定峰面积值比较稳定，离子之间转化幅度不大，且80℃提取30 min测定值和新配置的标准品测定值相差较小，因此本试验选择80℃提取30 min作为前处理条件。

2.1.2 提取液pH值影响

多聚磷酸根在水溶液中不稳定，溶液温度升高或酸性增强会加速其水解，生成磷酸根或更短链的聚磷酸根；若溶液中有酵素、络合阳离子等存在时会大大加快水解速度。但是改变溶液的pH值会使五种多聚磷酸根发生化学变化，影响测定结果的准确性。由于多聚磷酸根离子长时间在水溶液中（尤其是酸性溶液中）会发生自身酸水解现象，为保证方法的稳定性，实验中所用标准溶液的pH值均保持在碱性范围内。因此我们选择50 mmol/L氢氧化钠溶液作为提取液进行样品提取，使样品溶液pH（8～10）呈现碱性。

2.2色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

本实验通过比较AS19、AS11-HC等分析柱发现，不同型号的分析柱均能分离多聚磷酸盐，但是实验结果显示AS11-HC分析柱对三聚磷酸盐与三偏磷酸盐的分离效果最好，更加适合分析测定高浓度多聚磷酸盐，因此本实验最终选用Dionex Ionpac AS11-HC色谱柱进行多聚磷酸根的分离。

2.2.2 柱温的选择

本试验考察了5种多聚磷酸根在不同柱温情况下（25℃、30℃、50℃）的分离情况，结果发现柱温对磷酸根、焦磷酸根及六偏磷酸根的峰面积和峰高影响不大，但对三偏磷酸根和三聚磷酸根的峰面积和峰高以及分离度均有影响。所以对柱温选择时主要考虑三偏磷酸根和三聚磷酸根分离度以及出峰情况，分别选择浓度为2.5 μg/mL的三偏磷酸根和三聚磷酸根进行实验，实验结果表明当柱温为30℃时，三偏磷酸根和三聚磷酸根两种磷酸根相对应的信号最强且能够完全分离开来，因此柱温选择30℃。

2.2.3 进样体积的选择

液相色谱的测定多选择25 μL或50 μL作为进样体积，但在测定实际样品过程中发现，25 μL或50 μL样品上机响应值不高，因此增大进样体积，选择 100 μL进样量来以提高方法灵敏度。图1是5种多聚磷酸根混合标准溶液（10.0 mg/L）离子色谱图。其中峰1为正磷酸根（PO43-），出峰时间5.582 min；峰 2为焦磷酸根（P2O74-），出峰时间为12.487 min；峰 3为三聚磷酸根（P3O105-），出峰时间为14.153 min；峰4为三偏磷酸根（P3O93-)，出峰时间15.064 min；峰5为六偏磷酸根（P6O18）6-，出峰时间为 17.589 min。

2.2.4 线性范围、定量限及检出限

图1 10.0 mg/L时五种多聚磷酸根标准溶液的离子色谱图Fig.1 Ionchromatogram of standard solution of five polyphosphates

配制5种多聚磷酸根混合标准溶液系列，在最佳实验条件下，以峰面积为纵坐标（Y轴），质量浓度为横坐标（X轴），绘制标准曲线。五种多聚磷酸根的质量浓度以P5O2计，用浓度稀释法在10倍信噪比时（RSN）测得定量限，（PO4）3-、（P2O7）4-、（P3O9）3-、（P3O10）5-、（P6O18）6-的检出限为 0.5～3.0 mg/kg，定量限为 2.0～5.0 mg/kg。线性相关系数、线性方程及线形范围如表2所示。由表可知，目标化合物质量浓度与峰面积线性关系良好，线性范围、检出限均令人满意。

表2 5种多聚磷酸根的标准曲线线性方程和相关系数、线性范围及定量限Tab.2 The linearly relevant coefficient and equation,linear range,detection limit of five polyphosphates

2.2.5 方法的回收率和精密度试验

在确定了检测方法后，选取墨鱼丸、虾丸、日本黄姑鱼丸水产制品为研究对象，通过由低到高（50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg）的3个不同浓度梯度进行加标回收率和精密度实验，以考察方法的准确度和精密度。测定结果见下表3。由试验结果可知，低中高三个不同加标浓度梯度下，样品回收率在80%～100%之间，相对标准偏差均小于10%，该结果表明此方法完全能够满足水产加工制品中多聚磷酸盐的含量测定。

表3 不同加标浓度下的回收率和精密度实验（n=6）Tab.3 Results of recovery and precision of samples(n=6)

2.3实际样品测定

最佳实验条件下，对3种不同种类的实际水产加工品进行多聚磷酸盐的6次平行测定，墨鱼丸中（PO4）3-含量为 6.28 mg/kg（n=6），（P3O9）3-为 4.96 mg/kg（n=6），其他三种磷酸盐未检出；虾丸中（PO4）3-含量为 5.84 mg/kg（n=6），其他四种磷酸盐未检出；日本黄姑鱼丸中（PO4）3-含量为 5.61 mg/kg（n=6），（P3O9）3-为3.76 mg/kg（n=6），其他均未检出。结果表明试验中3种不同水产加工制品中多聚磷酸盐的含量均低于国家限量标准。

3 结论

本文采用离子色谱法测定水产加工制品中多聚磷酸盐的含量，通过对前处理和色谱条件的优化，确定了最佳实验条件，并成功应用于墨鱼丸、虾丸、日本黄姑鱼丸中5种多聚磷酸盐的检测。该方法具有快速、灵敏、适用范围广、准确度精密度高等优点，适用于水产加工制品中多级磷酸盐的检测。

[1]STEINHAUER J E.Food Phosphates for Use in The Meat,Poultry and Seafood Industry[J].Dairy and Food Sanitation,1983,3(7):244-247.

[2]王秀霞,胡 坤,方少瑛,等.多聚磷酸盐对猪肉丸质构特性的影响研究[J].肉类工业,2006(3):17-19.

[3]韩敏义,李巧玲,陈红叶.复合磷酸盐在食品中的应用[J].中国食品添加剂,2004,18(3):93-96.

[4]王莹莹.水产品中多聚磷酸盐的含量测定及风险评估[D].青岛:青岛大学,2012.

[5]WEINER M L,SALMINEN W F,LARSON P R,et al.Toxicological Review of Inorganic Phosphates[J].Food and Chemical Toxicology,2001,39(3):759-786.

[6]KOMABA H,FUKAGAWA M.Phosphate-a poison for humans[J].Kidney International,2016,90(4):753.

[7]张双灵.水产加工品中几种安全性因素危害分析、残留量检测与控制手段展望[D].杨凌:西北农林科技大学,2005.

[8]国内外食品添加剂使用规范和限量标准编委会.国内外食品添加剂使用规范和限量标准 [M].北京:中国标准出版社,2007.

[9]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB2760-2014食品安全国家标准,食品添加剂使用标准 [S].北京：中国标准出版社,2014.

[10]臧勇军,吴洪华,张 慧,等.微波消解-分光光度法测定肉制品中磷酸盐[J].肉类工业,2006(5):5-6.

[11]谢永洪,张新申,杨 坪,等.分光光度法测定磷酸盐的研究进展[J].皮革科学与工程,2009,19(2):35-41.

[12]毛艳贞,刘耀敏,宋 军,等.分光光度法测定饲料级磷酸盐中总磷含量[J].饲料研究,2012(3):72-74.

[13]曾汉和,卢康全.薄层色谱法测定肉类罐头中的多聚磷酸盐[J].食品与发酵工业,1987(2):50-55.

[14]高瑞昌,彭增起,陈德倡,等.多聚磷酸盐在鸡腿肉中水解的31P核磁共振研究[J].食品科学,2004,25(7):71-74.

[15]邵宏宏,周向阳,王 琦,等.离子色谱法同时测定海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐[J].食品科学,2014,35(20):248-252.

[16]王 雪,陈笑梅,朱 岩.离子色谱法测定冷冻水产品中的多聚磷酸盐[J].分析试验室,2008,27(7):82-84.

[17]王莹莹,高 华,张辉珍,等.离子色谱法测定水产品中的多聚磷酸盐[J].青岛大学学报:工程技术版,2011,26(2):74-78.

[18]李竹英,朱艳俊,汪 琼,等.离子色谱法测定水产品中的多聚磷酸盐[J].现代科学仪器,2009(4):104-106.

[19]凌约涛,郭 坚,王 帆.碱液提取离子色谱法测定水产品中多聚磷酸盐的研究[J].食品工业科技,2012,33(19):301-303.

[20]DAFFLON O,GOBET S H,BOSSET J O.Polyphosphate Determination in Seafood and Processed Cheese using High-Performance Anion Exchange Chromatography after Phosphatase Inhibition using Microwave Heat Shock[J].Mitteilungen Aus Lebensmitteluntersuchung Und Hygiene,2009,94(2):127-135.

[21]刘蓓蕾,贾海涛,剧京亚.离子色谱法测定肉及肉制品中多聚磷酸盐的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2014(2):503-507.

[22]李雪梅,陈 莹,张学梅,等.离子色谱法测定水产品中的多聚磷酸盐[J].辽东学院学报:自然科学版,2016,23(3):157-160.

[23]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB5009.256-2016食品中多聚磷酸盐的测定[S].北京:中国标准出版社,2016.

Determination of Polyphosphates in Aquatic Products by Ion Chromatography

CHANG Jia-qi1,2,MEI Guang-ming2,ZHANG Xiao-jun2,et al
(1.School of Food and Medical of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China）

A method for determination of polyphosphates in aquatic products was developed by ion chromatography.The condition of chromatography and pretreatment temperature and solutions,pH were optimized.The results showed that a good linear relationship can be found between the responsed value and the mass concentration while five polyphosphates(phosphate,pyrophosphate,tripolyphosphate,trimetaphosphate and hexametaphosphate)were in the range of 0.1-100,0.2-50,0.1-60,0.3-40,0.5-100 mg/L in the standard solution range,and the correlation coefficient was from 0.999 2 to 0.999 8.The detect limits of the five polyphosphates(phosphate,pyrophosphate,tripolyphosphate,trimetaphosphate and hexametaphosphate)in aquatic products in the range of 0.5-3.0 mg/kg while the quantitative limits from2.0 to 5.0 mg/kg,and the average recoveries of polyphosphates in seafood spiked at the levels of 50,100,200 μg/kg from 80.2 to 100.3,while relativestandard deviations all less than 9%.With the advantages of simple operation,fast detection speed,good selectivity,good accuary and high precision,the method could be used as an ideal method for determination of polyphosphates in aquatic products.

ion chromatography;polyphosphates;aquatic products;determination method

TS254.7

：A

2016-12-15

常家琪（1993-），女，河南漯河人，研究方向：食品加工与安全.E-mail:m15257074549@163.com

梅光明，高级工程师，研究方向：水产品质量安全.E-mail:meigm123@163.com

1008－830X(2017)01－0057－06