神舟十号飞船下行菌株Microbacterium sp．LCT⁃H2的基因组测序及分析

周 宏，谢 琼，刘长庭

（1.中国人民解放军总医院南楼呼吸科，北京100853；2.泰山医学院，泰安271000；3.中国航天员训练中心医监医保研究室，北京100094）

·基础研究·

神舟十号飞船下行菌株Microbacterium sp．LCT⁃H2的基因组测序及分析

周 宏1，2，谢 琼3，刘长庭1∗

（1.中国人民解放军总医院南楼呼吸科，北京100853；2.泰山医学院，泰安271000；3.中国航天员训练中心医监医保研究室，北京100094）

神舟十号飞船返回舱内表面分离得到一株下行菌株LCT⁃H2，显微观察和革兰氏染色结果为短杆状的革兰氏阳性菌，利用葡萄糖、纤维二糖等多种碳源，对该菌进行16S rRNA测序，鉴定其为微杆菌属成员，并命名为Microbacterium sp．LCT⁃H2。对该下行菌进行了全基因组测序和基因功能注释分析，其基因组大小为3.36 M，包括3235个编码序列和53个RNA基因，COG数据库比对共注释到21组COG功能分类。可对研究密闭飞行器内微生物种类分布等提供一定帮助。

微杆菌；太空飞行；全基因组测序；功能分类

1 引言

随着航天技术的发展，人类的外太空探索活动越来越频繁。尽管载人飞船及内部物品等经过严格的真空消毒，载人航天器密闭环境条件仍然容易滋生细菌和真菌等微生物，这些微生物能在密闭舱室内的金属、高分子复合材料等表面形成生物膜［1］，它们的生长繁殖和代谢会对材料产生腐蚀，严重威胁空间站的长期在轨运行安全，缩短空间站的服役时间［2］。研究密闭航天器内的微生物种类对于航天器内微生物的安全防护具有重要的意义。

早期人们对许多环境微生物的认识仅来自于对16S rRNA的研究［3］，一些重要的遗传信息很难获得。现在越来越多的新型培养方法和分子生物学方法，如基因组学、蛋白质组学、宏基因组学等，被用来研究新获得微生物的潜在特征和功能等［4］。

本研究围绕一株分离自神舟十号载人飞船返回舱内冷凝水的细菌Microbacterium sp．LCT⁃H2展开。通过16S rRNA测序鉴定该菌菌属，完成菌株基因组的高通量测序、基因注释分析和功能分类，研究该菌的表型及生理生化特征。

2 材料和方法

2.1 菌株与培养

菌株Microbacterium sp．LCT⁃H2为中国航天员训练中心自神舟飞船的返回舱内冷凝水分离得到。菌株分别于37℃培养箱或摇床中进行静置或振荡培养，液体培养基为脑心浸出液培养基（BHI，Oxiod），配方为37 g／L BHI；固体培养基为MH平板。

2.2 基因组DNA的提取

Microbacterium sp．LCT⁃H2接种至BHI液体培养基，37℃，180 rpm过夜培养，6000 rpm离心5 min收集菌体，弃上清。利用Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒（Code No.51304，详细步骤见产品说明书）提取收集的菌体的基因组DNA。

2.3 菌种鉴定及系统发育树构建

以Microbacterium sp．LCT⁃H2的基因组DNA为模板，利用细菌16SrRNA通用测序引物27F（5’⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3’）和1492R（5’⁃TACGGCTACCTTGTTACGACTT⁃3’）扩增其16S rRNA片段并测序，得到其碱基序列。用CLUSTALW［5］进行多序列比对，并用MEGA 5.0构建NJ系统发育树［6］。

参照Chen等[21]的方法，采用透析测定样品的释放情况。取10 mL样品于透析袋(分子截留量8 000～14 000 Da)中，密封好后浸没于200 mL的pH 7.0的PBST缓冲溶液中(吐温-20，0.5% v/v)。游离的丁香酚可透过透析袋进入到缓冲溶液中，而酪蛋白酸钠稳定微乳则被截留在透析袋中。在预定时间内，取出适量透析液，用相同的缓冲溶液稀释至适当浓度，280 nm下测定其吸光度并计算丁香酚释放的量，绘制释放曲线。

2.4 菌株性态及生理特性

2.4.1 菌体形态观察

采用革兰氏染色试剂盒（Code No.G1060，Solarbio）对LCT⁃H2菌体进行染色。BHI液体培养基过夜培养菌体，将菌液滴于载玻片中央，在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。结晶紫、沙黄染色液对干燥菌体一次染色脱色，详细步骤见产品说明书。染色完成并晾干后，置于光学显微镜下观察染色情况。

分别在透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）下观察菌体形态。1 ml培养至稳定前期的菌液，6000 rpm离心5 min收集菌体，弃上清；PBS缓冲液洗涤一次后将菌体悬浮至合适浓度。菌悬液等体积与4%多聚甲醛＋0.5%戊二醛溶液混合，滴在有支持膜的铜网上，15min后用滤纸吸取未吸附样品；吸取磷钨酸染液小心滴在铜网上，染色1 min后用滤纸吸取未吸附的样品；样品干燥后在Philips EM 400T型透射电子显微镜（TEM）下观察菌体形态。首先用2.5%戊二醛、PBS缓冲液以及1%锇酸清洗菌体，乙醇梯度脱水并乙酸异戊酯置换，样品干燥后做喷金处理［7］，处理好的样品置于FEIQuanta 200型扫描电镜下观察。

2.4.2 BIOLOG板分析

Biolog微孔板（Biolog GENIIIMicroPlate，Bi⁃olog）用来对LCT⁃H2菌株进行94种表型检测，其中包括71种碳源利用率分析和23种化学敏感性分析。Microbacterium sp．LCT⁃H2接种至BHI液体培养基，37℃，180 rpm过夜培养，6000 rpm离心5 min收集菌体，弃上清。将菌体用IF⁃B接种液悬浮并调节至适当浓度（OD600约为0.8），分别取100μL接种液加入Biolog微孔板的96个孔中，将微孔板放置在37℃培养箱中培养24 h后，用酶标仪测定590 nm各孔的吸光度值（OD590）［8］。

2.5 基因组测序、组装及注释

基因组DNA样品委托美吉生物有限公司进行全基因组序列测定、基因预测、基因功能注释、非编码RNA预测等工作，序列分析工作委托美吉生物有限公司和上海瀚宇生物科技有限公司共同完成。

基因组DNA提取后进行质量鉴定，在浓度和纯度达到测序要求后进行全基因组测序。利用Covaris进行基因组DNA片段化，构建插入片段约300～500 bp的基因组测序文库，通过桥式PCR扩增得到DNA簇，然后采用Illumina Hiseq 2000测序技术完成该菌株的基因组扫描测序，获得约1 Gb的原始测序数据。Illumina HiSeq2000测序得到的原始图像数据经过Base Calling转化为序列数据，结果以FASTQ文件格式来存储，包含测序read的序列信息以及测序质量信息［9］；原始数据经过预处理去除接头、引物及低质量数据后，利用SOAPdenovo［10］拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果，并运用Gap Closer软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正；分别利用RNAmmer和tRNAscan⁃SE软件对基因组中包含的rRNA和tRNA进行预测［11］；利用Glimmer 3.0软件进行基因预测［12⁃14］；利用各种数据库进行基因功能注释和分类。

3 结果与分析

菌株LCT⁃H2可在MH固体平板上形成无色、表面光滑且边缘整齐菌落。革兰氏染色后在光镜下观察，发现菌体被染成紫色，为革兰氏阳性菌特征（图1（a））。在透射电镜及扫描电镜下观察发现，菌体呈杆状，分散排布，表面没有鞭毛、菌毛等结构（图1（b）、（c））。

3.2 Microbacterium sp．LCT⁃H2菌株鉴定

利用通用引物测序得到的16S rRNA基因序列，构建多株细菌的系统发育树（图2），显示与Microbacterium属多个菌株位于一个大的系统分支，且与Microbacterium paraoxydans进化关系最近。Biolog微孔板结果表明LCT⁃H2菌株可利用多种碳源，包括单糖（葡萄糖、果糖、甘露糖等）、二糖（纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖等），多糖（果胶、糊精等）以及多种无机碳源等，对醋竹桃霉素（Troleandomycin）、硫酸四癸钠（Niaproof 4）、二甲胺四环素（Minocycline）等敏感（图3）。综合该菌在生理生化特征、16S rRNA基因同源性和化学指标等方面的实验结果，确定菌株LCT⁃H2是微杆菌属，命名为Microbacterium sp．LCT⁃H2。

3.3 基因组测序与分析

3.3.1 基因组序列基本信息

通过Illumin Hiseq2000平台测序，基于测序数据组装得到LCT⁃H2基因组大小为3 356 231 bp，GC含量为70.5%，共30个scaffold，46个contig。基因组组分分析发现，LCT⁃H2预测出3235个编码基因，总长度为3 084 376 bp，占基因组全长的91.9%。tRNA 50个，rRNA 3个。LCT⁃H2菌株的基因组序列具体信息详见表1。

3.3.2 基因组序列基本信息

用Glimmer 3.0软件对LCT⁃H2基因组的ORF进行预测，获得3235个编码基因，依据COG分类标准将1575个基因划分为21类，以英文大写字母表示每一类的代码，每一类基因的数量和功能见表2：RNA形成及修饰（A），共1个基因；能量产生和转化（C），共96个基因；细胞周期调控、细胞分裂、染色体分割（D），共15个基因；氨基酸运输代谢（E），共204个基因；核苷酸运输代谢（F），共57个基因；糖类运输代谢（G），共135个基因；辅酶运输代谢（H），共56个基因；脂质运输代谢（I），共66个基因；翻译、核糖体结构和生物合成（J），共121个基因；转录（K），共108个基因；复制、重组、修复（L），共80个基因；细胞壁、细胞膜合成（M），共59个基因；细胞运动（N），共11个基因；蛋白质修饰和折叠（O），共48个基因；无机离子运输代谢（P），共134个基因；次生产物合成、转运和分解（Q），共39个基因；一般功能预测（R），175个基因；功能未知（S），77个基因；信号转导机制（T），共48个基因；细胞内转运，分泌和膜泡运输（U），共23个基因；防御机制（V），共22个基因；还有1660个未能找到对应的COG分类。

表1 M icrobacterium sp．LCT⁃H2菌株基因组的核苷酸含量和基因计数水平Table 1 Nucleotide content and gene count levels of the genome

4 讨论

空间环境具有地面环境不存在的一些特殊环境因素，如微重力、高真空、离子辐射、电磁辐射和极度温差等，这些因素除了可以诱导空间环境微生物发生基因水平的改变，进而影响微生物的生物学性状和功能外，还会影响航天器材料、舱室环境等。

微杆菌属是一类广泛存在于土壤、昆虫、海洋、病患、植物等多种环境中的微生物［15］，曾有报道微杆菌属菌种可以引起人类、动物和植物疾病［16⁃18］。在神舟十号船返回舱内分离得的微杆菌属Microbacterium sp．LCT⁃H2，参与氨基酸运输代谢，糖类运输代谢，翻译、核糖体结构和生物合成等相关功能。

表2 LCT⁃H2基因组21个COG分类的基因数统计Table 2 Number of genes associated w ith the 21 general COG functional categories

5 结论

1）LCT⁃H2菌株经本研究鉴定为微杆菌属，并命名为Microbacterium sp．LCT⁃H2，为短杆状的革兰氏阳性菌。

2）Microbacterium sp．LCT⁃H2基因组大小为3.36 M，包括3235个编码序列和53个RNA基因，COG数据库比对共注释到21组COG功能分类。

（References）

［1］ Kim W，Tengra F K，Young Z，et al.Spaceflight promotes biofilm formation by Pseudomonasaeruginosa［J］.Plos One，2013，8（4）：e62437 1⁃8.

［2］ Novikova N D.Review of the knowledge ofmicrobial contami⁃nation of the Russianmanned spacecraft［J］.Microbial Ecol⁃ogy，2004，47（2）：127⁃132.

［3］ Handelsman J.Metagenomics：application of genomics to un⁃culturedmicroorganisms［J］.Microbiology andmolecular biol⁃ogy reviews，2004，68（4）：669⁃685.

［4］ Hemme C L，Deng Y，Gentry T J，et al.Metagenomic in⁃sights into evolution of a heavy metal⁃contaminated groundwa⁃ter microbial community［J］.The ISME journal，2010，4（5）：660⁃672.

［5］ CLUSTALW［EB／OL］.http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalw2／.

［6］ Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：molecu⁃lar evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731⁃2739.

［7］ 谢家仪，董光军，刘振英.扫描电镜的微生物样品制备方法［J］.电子显微学报，2005，24（4）：440⁃440. Xie Jiangyi，Dong Guangjun，Liu Zhenying.Methodsof pre⁃paringmicrobial samplesfor scanning electron microscope［J］. Journal of Chinese Electron Microscopy Society，2005，24（4）：440⁃440.（in Chinese）

［8］ Li J，Liu F，Wang Q，et al.Genomic and transcriptomic a⁃nalysis of NDM⁃1 Klebsiella pneumoniae in spaceflight reveal mechanisms underlying environmental adaptability［J］.Scien⁃tific Reports，2014（4）：6216.

［9］ Dolan P C，Denver D R.TileQC：a system for tile⁃based quality control of Solexa data［J］.BMC bioinformatics，2008， 9（1）：1⁃10.

［10］ SOAPdenovo［EB／OL］.http：／／soap.genomics.org.cn／.

［11］ Li R，Zhu H，Ruan J，et al.De novo assembly of human ge⁃nomeswith massively parallel short read sequencing［J］.Ge⁃nome Research，2010，20（2）：265⁃272.

［12］ Glimmer 3.0［EB／OL］.http：／／www.cbcb.umd.edu／soft⁃ware／glimmer／.

［13］ Delcher A L，Bratke K A，Powers E C，et al.Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with Glimmer［J］. Bioinformatics，2007，23（6）：673⁃679.

［14］ Lukashin A V，Borodovsky M.GeneMark.hmm：new solu⁃tions for gene finding［J］.Nucleic Acids Research，1998，26（4）：1107⁃1115.

［15］ KumariP，Bandyopadhyay S，Das SK.Microbacterium oryzae sp.nov.，an actinobacterium isolated from rice field soil［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiol⁃ogy，2013，63（7）：2442⁃2449.

［16］ Alonso⁃Echanove J，Shah SS，Valenti A J，etal.Nosocomial outbreak of Microbacterium species bacteremia among cancer patients［J］.Journal of Infectious Diseases，2001，184（6）：754⁃760.

［17］ Hodgkin J，Kuwabara PE，Corneliussen B.A novel bacterial pathogen，Microbacterium nematophilum，inducesmorphologi⁃cal change in the nematode C.elegans［J］.Current Biology，2000，10（24）：1615⁃1618.

［18］ Hisatoshi K，Subandiyah S，Ochiai H.Red stripe of rice is caused by a bacterium Microbacterium sp［J］.Journal of Gen⁃eral Plant Pathology，2000，66（2）：149⁃152.

Draft Genome Sequencing and Analysis of Strain M icrobacterium sp．LCT⁃H2 Isolated from ShenzhouⅩReturn Capsule

ZHOU Hong1，2，XIE Qiong3，LIU Changting1∗
（1.Nanlou Respiratory Disease Department，The 301 Hospital，Beijing 100853，China；2.Taishan Medical College，Taian 271000，China；3.Department of Medical Monitoring and Medical Support，China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094，China）

Microbacterium sp．LCT⁃H2 strain was a short⁃rod，Gram⁃negative strain isolated from in⁃side of the ShenzhouⅩreturn capsule，which could utilizemany carbon sources including glucose and cellobiose.LCT⁃H2 was identified as amember of the Microbacterium according to the sequence of 16S rRNA and the draftgenome sequence.The total size of the genomewas3，356，231bp with 3，235 protein⁃coding and 50 RNA genes.21 COG functional categorieswere annotated based on COG database.The resultsmay be helpful to the study ofmicrobial species distribution inside the space⁃craft.

Microbacterium；space flight；whole⁃genome sequencing；functional category

R856

A

1674⁃5825（2017）01⁃0109⁃05

2015⁃12⁃02；

2016⁃12⁃21

国家重点基础研究发展计划（973）（2014CB744400）；载人航天预先研究项目（040203）；全军医学科研“十二五”课题重点项目（BWS12J046）

周宏，女，博士，讲师，在站博士后，研究方向为微生物生化与分子生物学。E⁃mail：hongzhoujy＠hotmail.com

∗通讯作者：刘长庭，男，硕士，教授，研究方向为空间生命科学。E⁃mail：changtingliu＠sohu.com