重离子7Li辐射对玉米还原糖含量的影响研究

胡金山，耿金鹏，曹天光，安海龙，展永

（1.河北工业大学生物物理研究所，天津300401；2.华北理工大学化学工程学院，河北唐山063009）

重离子7Li辐射对玉米还原糖含量的影响研究

胡金山1，2，耿金鹏1，曹天光1，安海龙1，展永1

（1.河北工业大学生物物理研究所，天津300401；2.华北理工大学化学工程学院，河北唐山063009）

研究重离子7Li辐射对“永19”玉米自交系还原糖含量的影响.采用溴化钾压片法红外光谱定性表征玉米还原糖.优化3，5-二硝基水杨酸（DNS）法的最佳波长，在540 nm定量测定不同剂量重离子7Li辐射自交系的还原糖含量.提取液与标准品特征峰重合证明提取液为还原糖.定量结果表明10 Gy辐射还原糖含量高达4.50%，20和40 Gy辐射分别为3.94%、3.79%，而30和50 Gy辐射略低于对照（3.55%）.重离子7Li辐射对玉米还原糖含量有正负双重作用呈现出马鞍形曲线.

重离子7Li；辐射；还原糖；红外表征；3，5-二硝基水杨酸

0 引言

重离子辐射诱变是指利用加速器产生高能离子束轰击生物样品从而诱发突变，具有遗传稳定周期短、突变率高、突变频谱宽、生理损伤小等优点[1-2].重离子束在与生物介质作用时，将自身所携带大量能量沉积在其径迹上，具有明显的传能线密度高的特点，特别是在其布拉格峰处，表现出局部相对突出的生物学效应[3-5].不同于分子育种技术，重离子辐射诱变玉米育种并没有外源基因的导入，只是其自身DNA发生了突变或遗传重组[6].重离子辐射诱变结合常规育种方法选育性状变异明显，营养价值丰富，品质优良，适应不同生态区域种植的优良品种，对于创新玉米种质资源，培育具有自主知识产权的优良玉米品种，保障我国的粮食安全、食品安全都具有十分重要的意义.

经过7年13代在河北永年和海南陵水试验基地的加代培育，重离子7Li辐射诱变的“永19”玉米自交系表观性状已经稳定遗传.不同剂量7Li辐射处理出现明显的表观性状变异，比如出现高产、抗逆性增加、花药变色、早熟等优良性状[7].众所周知，作为重要的粮食作物，玉米的营养价值高低在新品种选育过程中起到至关重要的作用.已有证据表明12C辐射能够部分改善玉米蛋白和脂肪酸含量[8-9]，但重离子7Li辐射诱变玉米的营养组成和含量是否发生变化目前仍不清楚，国内外均未见相关报道.玉米还原糖营养价值丰富易于消化吸收，其含量变化是玉米营养品质的重要评价指标之一.目前还原糖大多采用DNS比色法测定，该方法受客观因素影响较小，具有可重复性强、检测灵敏度高等优点适于批量测定[10].

本研究采用红外表征配合DNS法对不同剂量重离子7Li辐射诱变玉米自交系的还原糖进行定性定量测定，揭示不同剂量7Li辐射对还原糖含量的影响规律，为重离子辐射诱变玉米育种理论的发展提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：“永19”玉米自交系种子由河北省永年农作物研究所提供，重离子辐射诱变实验2008年在中国原子能科学院HI-13串列加速器上完成，辐射剂量分别为0 Gy（CK），10 Gy，20 Gy，30 Gy，40 Gy和50 Gy，具体物理参数详见表1.通过在河北永年和海南陵水加代培育，按辐射剂量将不同单株混合传代选育优良性状，第1-3代变异明显，第4代后表观性状基本趋于稳定.还原糖分析所用玉米（图1）为2015年海南陵水基地培育的不同剂量7Li辐射处理后的第13代，CK同为第13代未辐射样品.

表1 HI-13加速器辐射处理物理参数Tab.1 Physical parameters of HI-13 accelerator radiation

图1 不同剂量重离子7Li辐射诱变的“永19”玉米自交系Fig.1 Different radiation doses of heavy ion7Li to“Yong 19”maize inbred line

试剂：盐酸、氢氧化钠、苯酚、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠、碘、碘化钾等均为分析纯；3，5-二硝基水杨酸、无水葡萄糖、溴化钾为光谱纯.

1.2 仪器与设备

美国NICOLET AVATAR 360傅立叶红外光谱仪；上海精科UV 765紫外可见分光光度计；德国SIGMA3-30K台式高速离心机；瑞士METTLER TOLEDO MX5超精密电子天平；国华电器HH-8数显恒温水浴；上海一恒DHG-9075鼓风干燥箱；上海阳光766-3远红外辐射干燥箱；固特超声波清洗机KQ-500DE.

1.3 方法

1.3.1 试剂配制

1）3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：分别称取6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L NaOH溶液，加入500 mL含有182.0 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入5.0 g苯酚和5.0 g无水亚硫酸钠搅拌至溶解，冷却加水定容到1 000 mL，棕色试剂瓶避光保存，放置一周后使用.

2）1 mg/mL葡萄糖标准溶液：将无水葡萄糖置于鼓风干燥箱98℃干燥直至恒重，准确称取1.000 0 g葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容到1 000 mL摇匀备用.

3）玉米还原糖提取液：将玉米自交系籽粒粉碎过0.25 mm筛，准确称取5.0 g玉米粉末加入50 ml蒸馏水，50℃、100 W超声辅助提取20 min，至还原糖溶解析出，25 000×g/min离心30 min，弃沉淀取上清液定容到100 mL.

1.3.2 红外光谱表征

首先将还原糖溶液在远红外辐射干燥箱中干燥成粉末.还原糖或葡萄糖分别与KBr按质量比1∶100在玛瑙研钵中均匀研磨.采用溴化钾压片法进行红外光谱表征，压片机压力20 MPa，作用时间1 min，压制出透明压片，采集待测样品的红外光谱，扫描累加5次，扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1.

1.3.3 DNS试剂最佳吸收波长的确定

取0.5 mL葡萄糖标准溶液于10 mL小试管中，加入1.5 mL的DNS试液，摇匀糖溶液，放入沸水浴中反应5 min，快速冷却至室温，加入蒸馏水定容到25 mL.紫外可见分光光度计分别扫描DNS试剂-水（空白）、葡萄糖显色液-水（空白）、葡萄糖显色液-DNS（空白）在470～600 nm范围内的吸收光谱.

1.3.4 葡萄糖标准曲线的绘制

按表2进行配置操作，充分混匀后沸水浴中加热5 min，快速冷却至室温，再分别向各试管中加入蒸馏水混匀定容到25 mL.以管1号为空白对照，在最佳波长条件下分别测定各管的吸光度.以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制吸光度-葡萄糖浓度标准曲线.

1.3.5 玉米自交系还原糖含量的测定

准确移取0.5 mL还原糖提取液于10 mL小试管中，加入1.5 mL DNS试剂，沸水浴中反应5 min，快速冷却至室温，蒸馏水定容到25 mL，以相同条件下不加还原糖提取液作为空白，在最佳波长条件下测定反应液的吸光度.还原糖提取和含量测定按不同辐射剂量随机选取5株玉米分5次单独进行，对应标准曲线查出还原糖溶液浓度，计算出玉米还原糖的百分含量及标准偏差（n=5）.

表2 葡萄糖标准溶液的配制Tab.2 Configure the glucose standard solution

图2 傅立叶红外光谱表征Fig.2 Fourier infrared spectrum characterization

2 结果与讨论

2.1 红外光谱表征

图2所示为红外光谱表征，图中两条曲线分别为玉米还原糖和葡萄糖标准品的傅立叶红外光谱.特征峰3 500～3 200 cm-1处为O-H的伸缩振动，提示有羟基存在；2 900 cm-1附近小尖峰为醛基C-H的特征峰；2 400～2 300 cm-1左右为羰基峰；1 700～1 600 cm-1附近为C-C特征峰，1 400 cm-1附近为C-H的面内弯曲震动；1 200～1 000 cm-1处为C-O的伸缩振动是糖醇的特征峰，550 cm-1左右为4个碳原子以上的亚甲基联动[7].由图2可知，还原糖与葡萄糖标准品主要特征峰基本重合，证明提取物质为还原糖.玉米还原糖与葡萄糖的峰形相似，峰高和峰面积不同，表明两者糖含量接近，但组分可能略有不同[11].

2.2 最佳吸收波长的确定

DNS试剂在中性或偏碱性条件下与还原糖共热反应，还原生成棕红色氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸，反应溶液的颜色和还原糖的含量在一定范围内呈正比[12].文献中关于DNS法测定还原糖的最佳波长有520、540和580 nm[13-14]等多种报道，各不相同相差较大.图3所示为470～600 nm扫描结果，最大吸收处的波长为470 nm，尽管选取最大吸收波长测定可以提高灵敏度，但在此波长下DNS试剂（DNS-水曲线）也有较强吸光严重干扰测定，结合葡萄糖标准溶液-水曲线可以看出，这种影响在波长小于530 nm的情况下一直比较明显.综合图3中3条曲线，在波长540 nm处显色剂和还原糖的影响相对最小，因此实验中选取540 nm为最佳测定波长.

2.3 葡萄糖标准曲线

不同浓度葡萄糖显色液在540 nm可见光下吸光度不同，吸光度与葡萄糖浓度基本成正比.图4所示为葡萄糖标准曲线，当葡萄糖标准品浓度在0.20～0.80 mg/mL范围内，葡萄糖与DNS试剂反应稳定、显色灵敏，葡萄糖浓度与对应的吸光度之间线性关系良好.葡萄糖标准曲线轻微偏离原点可能是由于配制DNS试剂过程中加入的酒石酸钾钠所致，尽管酒石酸钾钠的作用是防止溶解氧的侵入，促进显色稳定同时提高反应的显色灵敏度，但却减弱了亚硫酸钠对还原糖的保护作用，从而造成微量葡萄糖的分子结构遭到破坏而不显色[10].因此，在还原糖浓度较低的情况下对测定有轻微影响，造成实测结果相对偏低.

2.4 重离子7Li辐射剂量对玉米自交系还原糖含量的影响

按上述方法，分别对10 Gy、20 Gy、30 Gy、40 Gy和50 Gy 5种不同剂量重离子7Li辐射诱变的玉米自交系以及对照（CK）样品的还原糖进行测定.还原糖含量的定量结果详见图5，10 Gy辐射诱变玉米自交系的还原糖含量高达4.50%，20 Gy和40 Gy辐射分别为3.94%和3.79%，而30 Gy和50 Gy辐射分别为3.39%和3.28%略低于对照样品（3.55%）.与对照相比，不同剂量处理组差异显著（P＜0.05）.当辐射剂量达到60 Gy或更大时，由于玉米田间出苗率急剧下降且超过半数致死，因此没有进一步跟踪统计.显而易见，重离子7Li辐射诱变能够部分改善玉米自交系还原糖的含量，对玉米自交系的还原糖含量有正负双重效应，呈现出类马鞍形的“M”曲线.

图3 波长扫描Fig.3 Wavelength scan

图4 葡萄糖标准曲线Fig.4 The glucose standard curve

图5 重离子7Li辐射剂量对还原糖含量的影响Fig.5 Effects of heavy ion7Li radiation doses on reducing sugar content

吴跃进[15]早期研究N离子注入水稻的生物效应时，发现低能重离子的剂量-存活率曲线呈马鞍型.之后众多研究表明细菌、植物细胞及种子中均存在因重离子辐射而产生的马鞍形剂量-存活率效应[16-17]，该现象引起了科研人员的广泛关注.耿金鹏报道了不同剂量重离子7Li辐射对“永19”玉米株高、穗位高也有马鞍形效应出现[7].邵春林综合能量、质量沉积和电荷协同效应提出了EMC模型从理论角度阐述马鞍形产生的机理[18].尽管该理论模型与部分实验数据吻合较好，但依然缺乏直接的实验证据来揭示机理.结合重离子7Li辐射对还原糖含量的影响，我们推测重离子辐射首先引起DNA的损伤修复并最终影响还原糖含量积累，马鞍形剂量效应可能是一种普遍的辐射诱变效应.

目前，关于重离子7Li辐射诱变究竟如何影响玉米自交系的蛋白、氨基酸、脂肪酸等其它营养成分仍不清楚，尚有待于进行深入系统的研究，进而从营养学角度生物大分子水平为重离子辐射玉米种质资源创新提供依据.

3 结论

1）红外光谱表征可以作为鉴定玉米还原糖的一种佐证手段，应用DNS法可以在540 nm对玉米还原糖进行快速定量分析.

2）10 Gy重离子7Li辐射能够显著提高玉米自交系还原糖含量.

3）重离子7Li辐射对还原糖含量有正负双重效应，还原糖含量随辐射剂量出现类马鞍形的“M”曲线.

致谢：承蒙中国原子能科学院北京串列加速器核物理国家实验室和河北省永年农作物研究所的鼎力相助，特此感谢!

[1]Zhou L B，Li W J，Yu L X，et al.Linear energy transfer dependence of the effects of carbon ion beams on adventitious shoot regeneration from in vitro leaf explants of Saintpaulia ionahta[J].International Journal of Radiation Biology，2006，82（7）：473-481.

[2]周利斌，李文建，曲颖.重离子束辐照育种研究进展及发展趋势[J].原子核物理评论，2008，25（2）：165-170.

[3]Blakely E A，Kronenberg A.Heavy-ion radiobiology：New approaches to delineate mechanisms underlying enhanced biological effectiveness[J].Radiation Research，1998，150（5s）：126-145.

[4]Pathak R，Dey S K，Sarma A，et al.Cell killing，nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of16O，12C and7Li[J].Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2007，632（1）：58-68.

[5]曲颖，李文建，周利斌，等.重离子辐射植物的诱变效应研究及应用[J].原子核物理评论，2007，24（4）：294-298.

[6]Zhu C，Naqvi S，Gomez-Galera S，et al.Transgenic strategies for the nutritional enhancement of plants[J].Trends in Plant Science，2007，12（2）：548-555.

[7]耿金鹏，李多芳，曹天光，等.重离子辐射玉米自交系田间性状的统计分析[J].玉米科学，2013，21（2）：66-70.

[8]仲彩萍，李唯，陈学君.重离子辐照对玉米自交系营养品质的影响[J].甘肃农业大学学报，2010，45（5）：29-34.

[9]陈学君，栗孟飞，李唯，等.SFE-GC/HPLC对重离子辐照育种的玉米油中五种营养物质的含量分析[J].营养学报，2012，34（5）：496-500.

[10]赵凯，许鹏举，谷广烨.3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究[J].食品科学，2008，29（8）：534-536.

[11]邓月娥，孙素琴，牛立元，等.奶粉主要营养成份的傅里叶变换红外光谱法分析[J].营养学报，2007，29（1）：91-93.

[12]Hu R F，Lin L，Liu T J，et al.Reducing sugar content in hemicellulose hydrolysate by DNS method：A revisit[J].Journal of Biobased Materials and Bioenergy，2008，2（2）：156-161.

[13]Saqib A N，Whitney P J.Differential behaviour of the dinitrosalicylic acid（DNS）reagent towards mono-and di-saccharide sugars[J].Biomass and Bioenergy，2011，35（11）：4748-4750.

[14]Wood I P，Elliston A，Ryden P，et al.Rapid quantification of reducing sugars in biomass hydrolysates：Improving the speed and precision of the dinitrosalicylic acid assay[J].Biomass and Bioenergy，2012，44：117-121.

[15]吴跃进.离子注入水稻生物学效应和基因转导若干研究[D].合肥：中国科学院等离子体物理研究所，1997，19-25.

[16]Huang W D，Yu Z L.A dose-survival model for low energy ion irradiation[J].International Journal of Radiation Biology，2007，83（2）：133-139.

[17]韩荣飞，吴跃进，卞坡，等.低能重离子剂量-存活率效应及其拟合模型探讨[J].原子核物理评论，2009，26（4）：352-355.

[18]邵春林，余增亮.离子束辐照下微生物、植物组织存活模型的研究[J].核技术，1997，20（7）：423-430.

[责任编辑 代俊秋]

Effects of heavy ion7Li irradiation on maize reducing sugar content

HU Jinshan1，2，GENG Jinpeng1，CAO Tianguang1，AN Hailong1，ZHAN Yong1

（1.Institute of Biophysics,Hebei University of Technology,Tianjin 300401,China;2.College of Chemical Engineering,North China University of Science and Technology,Hebei Tangshan 063009,China）

An investigation demonstrated the effects of heavy ion7Li irradiation on“Yong 19”maize inbred lines'reducing sugar content.Using KBr tableting technique,maize reducing sugar was qualitatively characterized by infrared spectrum.Then,optimized the wavelength for 3,5-dinitro salicylic acid(DNS）determination,all the reducing sugars from different doses of heavy ion7Li treated inbred lines were quantitatively measured at 540 nm.These characteristic peaks of extraction and standard were coincident,which proved that the extraction was reducing sugar.The quantitative results showed that reducing sugar content of 10 Gy radiation reached as high as 4.50%,20 and 40 Gy radiation were 3.94%and 3.79%,whereas 30 and 50 Gy radiation were slightly lower than that of the control sample(3.55%).It indicated that heavy ion7Li irradiation has both positive and negative effects on maize reducing sugar content,which presented a kind of saddle-type curve.

heavy ion7Li;irradiation;reducing sugar;infrared characterization;3,5-dinitro salicylic acid

Q691

A

1007-2373（2017）03-0008-05

10.14081/j.cnki.hgdxb.2017.03.002

2016-12-15

河北省自然科学基金（B2014209314，C2013202192）；河北省高等学校科学技术研究项目（ZD2017023）；唐山市科技计划（13130225z）

胡金山（1979-），男，副教授，博士研究生.通讯作者：展永（1954-），男，教授，博士生导师.