蛋白同化雄性类固醇检测技术研究进展

李国俊

摘 要：蛋白同化雄性类固醇是一类滥用最为普遍的禁用物质， 对其进行有效的控制和检测关系到运动员的身心健康和体育比赛的公平公正。对该类禁用物质分析方法的改进和发展是目前兴奋剂检测的重要任务。该文通过对蛋白同化雄性类固醇使用现状的分析，结合里约奥运会类固醇检测技术的研究分析和近两年在国内外期刊发表的有关类固醇检测方面的文献进行归纳总结，以为相关机构开展有关研究提供借鉴依据。

关键词：蛋白同化雄性类固醇 检测 长效代谢物

中图分类号：R87 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）06（a）-0252-02

1 蛋白同化雄性类固醇在体育领域使用现状分析

蛋白同化雄性类固醇具有三个特点，一是具有蛋白同化的生理活性，其蛋白同化作用可以增加蛋白质合成， 促进肌肉增长和红细胞生成， 增强力量和耐力；二是属于雄性激素，而雄性激素作用可以使男性性特征更加明显；三是该类物质从化学结构性质上属于类固醇，它是广泛分布于生物界的一大类环戊稠环全氢化菲衍生物的总称， 又称甾醇、甾族化合物。

20世纪50年代，前苏联举重运动员开始通过服用雄性激素睾酮增加力量。到20世纪60年代，竞技运动员使用类固醇激素的现象已非常普遍，因而国际奥林匹克委员会（IOC）将这类物质判定为兴奋剂而明令禁止。目前，在所有禁用物质当中，蛋白同化雄性类固醇仍然是滥用最为普遍的物质，在世界反兴奋剂机构“2015 Anti-Doping Testing Figures”可以看出， 2015年世界反兴奋剂机构认可的兴奋剂检测实验室所提供的阳性物质统计中，蛋白同化雄性类固醇阳性率仍然达到50%～60%。国际举重联合会公布国际奥委会复检北京、伦敦奥运会样品阳性结果，大多涉及类固醇的长效代谢物。

类固醇类兴奋剂的滥用严重影响到体育比赛的公平、公正性， 且长期使用这类兴奋剂会严重干扰人体的自然激素平衡， 导致异性化现象，男性运动员使用会出现胸部增大，睾丸缩小，女性化特征明显，而女性运动员使用会出现喉结，体毛加重，痤疮等男性化特征，甚至可能引起严重的肝、肾损伤， 并发肝癌、心脏病， 并产生药物依赖， 少数人还可能出现严重的情感及精神病症。

在世界反兴奋剂机构《2016年禁用清单国际标准》中，蛋白同化雄性类固醇分为两类，一是外源性蛋白同化雄性类固醇，如氯司替勃、去氢氯甲睾酮、美雄酮等。另一类是外源性摄入内源性蛋白同化雄性类固醇，代表物质包括双氢睾酮、普拉睾酮、睾酮等。内源性蛋白同化雄性类固醇是指人体自身能够分泌，外源性是指人体自身不能分泌而经人工合成的。

2 类固醇常规分析方法

目前国际奥委会（IOC）规定的蛋白同化雄性类固醇类物质的标准分析方法是采用气相色谱-质谱（GC-MS）方法分析尿样， 选择特定的特征离子进行监测。尿样一般先经酶解除去蛋白质等生物大分子， 之后经固相萃取或液-液萃取对目标物质进行初步的分离富集， 将得到的被分析物进行三甲基硅烷化衍生后即可进入毛细管气相色谱分析， 常通过四极杆质谱监测特征离子。这类方法对绝大多数外源性雄性类固醇能够获得比较可靠的分析结果。

3 外源性类固醇的检测进展

对于判断运动员是否使用了外源性类固醇激素， 需要检测尿液中是否存在该物质或其代谢物或标记物即可。目前，在外源性类固醇的检测方面，主要的研究进展是使用高分辨静电场轨道离子阱技术发现一些运动员经常使用的类固醇类药物的长效代谢物，使检测窗口期延长，提高阳性检出率。下面就里约奥运会类固醇检测技术以及近两年在国内外发表的类固醇检测技术的期刊内容进行统计。

在Loanna Athanasiadou [1]研究表明，通过长效代谢物的发现，使得里约奥运会类固醇检测窗口期大大延长。如司坦唑醇通过检测它在尿液中的代谢物17-表司坦唑醇-N-葡萄糖甙，使得该物质检测窗口期延长到停药25 d左右；对于去氢氯甲睾酮，发现了它的代谢物去氢氯甲睾酮代谢物3，使得该物质检测窗口期延长到45 d左右；又如氧雄龙，它的原形在体内仅能存留5 d左右时间，而氧雄龙代谢物1检测窗口期延长到15 d，氧雄龙代谢物2检测窗口期延长至约20 d。

“Sulfate metabolites as alternative markers for the detection of 4-chlorometandienone misuse in doping control”[2]一文中指出，24岁男性一次口服5 mg的氯美雄酮，留取服药后8 d的尿液；49岁男性，一次口服20 mg的氯美雄酮，同样留取服药72 h后的尿液，在两名志愿者留取的尿液中都發现了多种代谢物。

Georgina Balcells等[3]采用液相色谱串联质谱检测，进行了单次口服甲睾酮（10 mg，3位志愿者）或司坦唑醇（6 mg，4位志愿者）的临床实验，收集了受试前至受试后31 d的尿样，分别在22 d和21 d的代谢实验的尿样中检出甲睾酮和司坦唑醇代谢物，说明这种检测策略的有效性。

Jianghai Lu等[4]的研究表明，采用液相色谱飞行时间质谱法检测人体尿液中氯司替勃新型代谢物，文中指出，氯司替勃原形在尿液在3 d左右便不能检测出来，而发现的氯司替勃代谢物s1检测窗口期延长到停药后25 d。

A. G. Fragkaki[10]的研究表明，实验中两名高加索志愿者男性，分别口服25 mg美替诺龙乙酸酯，留取了用药后632 h的尿液，并比较了液相色谱高分辨质谱和气相色谱高分辨质谱检测灵敏度的区别，第一名志愿者无论采用液相色谱高分辨质谱还是气相色谱高分辨质谱，都能将检测窗口延长到12 d左右。第二名志愿者检测窗口期略短，约10 d左右。说明不同个体在服药后代谢情况并不完全一致。

Thomas Piper等[11]的研究表明，39岁高加索男性，口服氘代诺龙40 d（溶于20 mL50%乙醇水中），采用氢同位素比质谱和高分辨质谱检测诺龙长效代谢物，发现了它的新型代谢物。

4 內源性类固醇的检测

对于内源性类固醇的检测，目前主要结合使用类固醇生物护照模块，对运动员尿液中的参数进行长期纵向跟踪，通过个人的数值建立参考范围，如果出现异常来判断阳性[1]。目前生物护照类固醇模块尚未报告阳性，但是通过生物护照提供的线索，在使用同位素质谱法确证阳性。类固醇生物护照的广泛运用为检测内源性蛋白同化雄性激素和一些经修饰过且未囊括在世界反兴奋剂禁用清单的新雄性激素提供了坚实保证。

参考文献

[1] Ioanna Athanasiadou， Sven Voss， Emmanouil Lyris， et al. Analytical progresses of the World Anti-Doping Agency Olympic laboratories： a 2016 update from London to Rio， Bioanalysis， 2016，8（21）：2265.

[2] G Balcells，C Gomez，L Garrostas，et al.Sulfate metabolites as alternative markers for the detection of 4-chlorometandienone misuse in doping control[M].Drug test anal，2016.

[3] Georgina Balcells， Oscar J. Pozo， Argitxu Esquivel， et al， Screening for anabolic steroids in sports： Analytical strategy based on the detection of phase I and phase II intact urinary metabolites by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A， 2015，1389：65.

[4] Jianghai Lu， María Fernández-？lvarez， Sheng Yang， Genye He， Youxuan Xu， R.Aguilera， New clostebol metabolites in human urine by liquid chromatography time-of-flight tandem mass spectrometry and their application for doping control[J].Journal of Mass Spectrometry， 2015， 50（1）：191.

[5] A. G. Fragkaki， Y. S. Angelis， P. Kiousi， C. G. Georgakopoulos， E. Lyris， Comparison of sulfo-conjugated and gluco-conjugated urinary metabolites for detection of methenolone misuse in doping control by LC-HRMS， GC-MS and GC-HRMS[J].Journal of Mass Spectrometry， 2015，50（5）：740.

[6] Thomas Piper， Wilhelm Schnzer， Mario Thevis.Revisiting the metabolism of 19-nortestosterone using isotope ratio and high resolution/high accuracy mass spectrometry[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2016，162：80.