2种果蝇取食后樱桃可培养微生物多样性的动态变化

高欢欢 王文博 吕召云

摘要 [目的]确定黑腹果蝇和斑翅果蝇取食后樱桃微生物的动态变化。[方法]利用2种果蝇分别取食樱桃、共同取食樱桃和自然腐烂4种处理方式，经过2、4、6、8、10、12 d后，采用16S rDNA和ITS基因分析的方法分离鉴定樱桃中的微生物。[结果]所有处理共分离鉴定出16种细菌和12种真菌。随着时间的延长，不同处理樱桃中微生物的动态发生了变化。自然腐烂8～12 d的樱桃中微生物种类增多，优势细菌种群为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）；黑腹果蝇取食第6天，微生物种类最多，优势细菌种群为厚壁菌门；而斑翅果蝇以及2种果蝇同时取食樱桃2 d后微生物种类就开始增加，可见斑翅果蝇的取食改变了微生物的多样性，从而加快了樱桃腐烂的速度，随后黑腹果蝇形成二次为害；另外，在2种果蝇取食后的樱桃中，白地霉（Geotrichum candidum）是樱桃中较稳定的优势真菌种群，但在自然腐烂的樱桃中并未发现。[结论]该研究可为探索微生物、樱桃、果蝇三者之间的协同进化关系提供理论依据。

关键词 斑翅果蝇；黑腹果蝇；樱桃；微生物多样性；动态

中图分类号 Q969.462.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0155-05

Abstract [Objective] The aim was to understand the dynamics of microbial diversity in natural cherry and the cherry treated by Drosophila suzukii and Drosophila melanogaster. [Method] The dynamics of microbial diversity in natural cherry and the cherry treated by Drosophila suzukii and Drosophila melanogaster， separately， and together， microorganisms in cherry treated by D. suzukii and D. melanogaster， for 2， 4， 6， 8， 10， 12 days were separated， purified， and identified through ITS and 16S rDNA genetic analysis. [Result] The Results showed that， 16 bacterial species and 12 fungi species were identified from all the materials. The dynamic of microbial diversity was changed with the increasing of time. The microorganism species was abundant from 8 to 12 day under the natural condition. The dominant populations of bacteria were Pseudomonas fluorescens and Staphylococcus sp.. After fed by D. melanogaster for 6 days， the largest number of microorganism species occurred at the 6th day and the bacteria of Firmicutes were dominant populations. While fed by D. suzukii or by two species of Drosophila together， the microorganism species increased from 2 to 6 day. It was concluded that，the decay of cherry was accelerated due to that the microbial diversity in cherry was changed by D. suzukii. D. melanogaster formed continuing harm through the mechanical injury from D. suzukii. in which the dominant populations of bacteria were the bacteria of Proteobacteria. Moreover， Geotrichum candidum was the steady and dominant fungus in cherry treated by Drosophila species but absent in the natural cherry. [Conclusion] This study provides a theoretical foundation for investigating coevolution among cherry， Drosophila sp. and microorganisms.

Key words Drosophila suzukii；Drosophila melanogaster；Cherry；Microbial diversity；Dynamics

山東省是甜樱桃的生产大省，种植面积已超过5.0万hm2，占全国的45.6%，产量和面积均居全国第一[1]，产品输出量很大，经济效益较为显著。近年来，樱桃生产中发现虫害问题，其中黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和斑翅果蝇（D.suzukii）的种群密度较大，二者隶属双翅目果蝇科，寄主广泛，包括樱桃、草莓、葡萄等60多种植物，在全世界各地均有发现[2-3]。黑腹果蝇喜爱在腐烂的果实上产卵取食[4]；斑翅果蝇雌虫的产卵管一侧生有许多小锯齿，呈镰刀状，坚硬狭长[5]，偏好在刚开始成熟变色的水果上产卵，孵化为幼虫后蛀食果肉为害，果实逐渐软化以致变褐腐烂，可造成高达40%～80%的产量损失[6]。因此，后者对樱桃等水果的危害则更严重。

腐烂的果实中会滋生大量微生物，可对2种果蝇幼虫的生长发育起到促进作用[7]。Milan等[4]发现，腐烂水果中的酵母可以为果蝇的生长发育提供营养物质和必需氨基酸。当食物中酵母的数量低于0.1%时，黑腹果蝇1龄幼虫死亡率显著上升[8]。微生物群落还可影响果蝇的嗅觉和产卵行为，相对于单一的微生物环境，黑腹果蝇趋向于在酵母和醋酸菌共存的微生物环境中产卵，2种微生物参与果蝇体内乙醇、醋酸的代谢，产生的次级代谢产物有利于果蝇的生长发育[9]。因此，果蝇生存环境中的微生物对果蝇的生长发育和种群繁衍具有不可或缺的作用。樱桃作为果蝇重要的寄主之一，腐烂过程中微生物多样性的动态变化是了解果蝇与微生物协同进化关系的关键所在，但鲜见相关报道。为此，笔者将黑腹果蝇和斑翅果蝇分别或者同时取食新鲜樱桃，随着取食时间的增加，观察微生物多样性的动态变化，分析了微生物与2种果蝇生长发育的关系，旨在为研究果实、微生物和果蝇三者之间的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源。

黑腹果蝇和斑翅果蝇采集于山东省济南市历城区柳埠镇王家峪村（117°10′E，36°27′N）樱桃园中，饲养于人工气候箱中，温度（25.0±0.5）℃，湿度为70%±0.5%，光周期（L∶D）为16∶8 h，饲养4～5代后取羽化3 d的活体成虫以及在樱桃园中采摘的新鲜樱桃用于试验。

1.1.2 主要仪器与试剂。

超净工作台（SW-Cj-ZFD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、人工气候箱箱（RXZ-328A型，宁波江南仪器厂）、离心机（D-78532，德国Tuttlingen）、PCR仪（EPS301，美国Pharmacia公司）、电泳仪（JY3000，北京君意东方电泳设备有限公司）、凝胶成像系统（JY04S-3C，北京君意东方电泳设备有限公司）。

NB培养基、孟加拉红培养基、PDA培养基、PBS缓冲液、DNA提取试剂盒（Fungal DNA Kit D3390-01，OMEGA BIO-TEK公司）、2×Taq Plus PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同腐烂程度的樱桃中微生物的分离。

在高压灭菌过的组织培养瓶（直径5.5 cm，高9.0 cm）中放入新鲜樱桃，分别接入4对斑翅果蝇、4对黑腹果蝇成虫以及斑翅果蝇和黑腹果蝇各2对，为保证果蝇的生命力，同时放入少量蜂蜜水，以不放入果蝇为自然腐烂处理，每个处理5个重复，分别取食2、4、6、8、10、12 d后，在无菌条件下将所取样品在PBS缓冲液中匀浆，吸取匀浆液稀释1×103、1×104和1×105倍。在各个处理中不同浓度的混合液中吸取400 μL，分别涂布于NB板和孟加拉红培养基平板上，每个浓度3次重复。涂板后放置25 ℃培养箱中培养，NB培养基培养48 h，孟加拉红培养基培养72 h。经过纯化培养后，挑取纯化好的各细菌菌落在LB液体培养基中过夜，摇匀，一部分用于16S rDNA鉴定，一部分加入等体积的60%甘油，-20 ℃保存，备用。

1.2.2 微生物分离物的基因鉴定。

1.2.2.1 细菌分离物的16S rDNA鉴定。

对于分离纯化后的细菌采用16S rDNA鉴定法。以過夜、摇匀的菌液作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：DNA模板2.0 μL，2.0×Taq Plus PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加入ddH2O补充至25.0 μL。PCR反应程序：94 ℃预热 3 min，94 ℃热变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃反应后延伸 5 min。

引物序列，16S rDNA-27F：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′；16S rDNA-1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.2.2.2 真菌的ITS鉴定。

对于分离纯化后的真菌采用ITS鉴定法。在铺有玻璃纸的PDA培养基种收集真菌的菌丝，按照DNA提取试剂盒（Fungal DNA Kit D3390-01）提取各个真菌的DNA，通过1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测合格后-20 ℃保存备用。PCR反应体系及反应程序同“1.2.2.1”。

引物序列，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.2.2.3 测序分析。

将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定16S rDNA和ITS的条带分别为1 500 kb左右和500 kb左右后，切胶回收，送上海生工生物工程有限公司测序部测序，将测序结果在NCBI网站上进行Blast分析，寻找同源性最高的16S rDNA和ITS基因序列，并以此来判断微生物的分类地位。

2 结果与分析

2.1 樱桃中的细菌种类及系统发育树

经过分离和鉴定，在斑翅果蝇、黑腹果蝇取食以及2种果蝇同时取食不同时间的樱桃中共分离到16种细菌（表1）。细菌主要隶属变形菌门、厚壁菌门和放线菌门，其中变形菌门γ-变形菌纲包括8种细菌，分别是比林欧文菌（Erwinia billingiae）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、沙雷氏菌（Serratia sp.）、雷氏普罗威登菌（Providencia rettgeri）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、菠萝泛菌（Pantoea ananatis）、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），厚壁菌门包括葡萄球菌属（Staphylococcus sp.），以及3种芽孢杆菌纲细菌，分别是台中类芽孢杆菌（Paenibacillus taichungensis）、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）和蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。有4种不动杆菌属细菌（Acinetobacter sp.）隶属于放线菌门，其系统发育树见图1，经过Blast分析后，与NCBI核苷酸数据库中已有的细菌序列达到99%的同源性。

2.2 樱桃中的真菌种类及系统发育树

在3种处理方式下的樱桃中分离鉴定得到12种真菌（表2）。其中，7种细菌隶属于半知菌亚门，包括白地霉（Galactomyces candidum）、2种青霉属真菌（Penicillium sp.）、柄蓝状菌（Talaromyces minioluteus）、4种曲霉属真菌（Aspergillus sp.）、层生镰刀菌（Fusarium proliferatum）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）。其系统发育树见图2，经过Blast分析后，与NCBI核苷酸数据库中已有的真菌序列同源性较高。

2.3 樱桃中微生物多样性的动态变化

不同的果蝇取食后，樱桃中的细菌种类差异很大。樱桃在自然腐烂的情况下分离得到5种细菌、7种真菌；斑翅果蝇取食后的樱桃中分离得到10种细菌、3种真菌；黑腹果蝇侵染后分离得到10种细菌、8种真菌；2种果蝇同时取食后分离得到11种细菌、8种真菌。可见，黑腹果蝇参与取食的樱桃中，细菌和真菌的种类均多于自然腐烂的樱桃和斑翅果蝇取食的樱桃；而因斑翅果蝇取食而产生的真菌种类较少。

随着时间的变化，在自然腐烂的樱桃中，第10天微生物种类较多，分离得到4种细菌和7种真菌；在斑翅果蝇刚刚取食樱桃2 d后，微生物种类已较多，其中细菌6种，真菌1种，为白地霉，第4天丰富度急剧减少，第10天仍有5种细菌，但种类已发生变化，真菌增加至3种；黑腹果蝇取食后的樱桃中细菌种类在第6天时最多，其中细菌7种，真菌8种，但过于腐烂的樱桃（10 d以后）中微生物的种类反而有所减少；2种果蝇同时取食后，樱桃内的微生物种类在第2～6天时均较多，6 d以后微生物种类开始下降（表1、2）。

在微生物种类分布方面，自然腐烂的樱桃中，变形菌门的荧光假单胞菌和葡萄球菌为细菌优势种群，真菌的优势种群为青霉属和曲霉属真菌，属于半知菌亚门。而果蝇取食后，樱桃中的微生物种类变化很大。斑翅果蝇取食后的樱桃中，前期优势细菌种群并不明显，后期变形菌门细菌占据优势地位，真菌种类则主要为半知菌亚门的白地霉；黑腹果蝇取食后，细菌优势种群为厚壁菌门的芽孢杆菌，真菌优势种群属于半知菌类真菌；2种果蝇同时取食樱桃后导致第2～6天细菌和真菌多样性明显增加，但白地霉是樱桃中比较稳定的优势真菌种类，同样，接合菌亚门的卷枝毛霉也是果蝇取食后滋生的真菌，在自然腐烂的樱桃中并未发现（表1、2）。

3 结论与讨论

樱桃作为斑翅果蝇和黑腹果蝇最重要的寄主植物，该研究利用2种果蝇取食樱桃，对不同腐烂程度的樱桃进行微生物的分离和鉴定，共培养获得16种细菌和12种真菌，2种果蝇取食后樱桃中的微生物种类差异并不大，但与自然腐烂的樱桃相比，微生物的多样性发生了明显变化。

斑翅果蝇取食樱桃后第2天，微生物种类较多，新鲜的樱桃硬度较高[10]，斑翅果蝇的产卵器特化为锯状，可以刺破果皮产卵，而黑腹果蝇则无法顺利地产卵取食，只能以蜂蜜水为食。而在第6天，樱桃果皮硬度下降，黑腹果蝇产卵量和取食量增加，导致微生物种类达到最多，表明斑翅果蝇在樱桃前期产卵造成的伤口可以为黑腹果蝇的产卵提供通道，由此增加了微生物的多样性。另外自然腐烂8～12 d的樱桃中，微生物种类较多，但细菌种类仍然少于果蝇取食后的樱桃，果蝇取食前后导致的微生物多样性差异可能与果蝇自身肠道内的微生物有关，昆虫取食寄主后，肠道内的微生物经过昆虫的取食和排泄过程会传递到寄主体内，可使其微生物多样性发生动态变化。黑腹果蝇成虫肠道中的微生物群落比较稳定，有10余种微生物，以醋酸菌和乳酸菌为主，但幼虫中的微生物群落并不稳定，与寄主植物本身有关[11]。高欢欢等[12]在黑腹果蝇取食后的葡萄中发现大量醋酸菌的存在，该研究中，2种果蝇取食后的樱桃中均未发现醋酸菌和乳酸菌，而是以多种致病菌为优势种群，这与樱桃中本身存在的多种致病菌有关。

该研究中，在果蝇取食过程中，白地霉（Geotrichum geotrichum）是唯一持续存在的真菌。白地霉是水果中常见的真菌[13]，令桢民等[14]发现白地霉可以参与腐烂果实中产生的正己醇代谢，但也能够加速果实的腐烂[15]。由此可见，白地霉在与樱桃和果蝇的关系中具有重要的作用，已有研究证明白地霉可以促进斑翅果蝇的生长发育，缩短其发育历期[16]。在黑腹果蝇取食后的第6天，产生了大量的青霉属真菌（Penicillium sp.）、曲霉属真菌（Aspergillus sp.）和毛霉属真菌（Mucor sp.）。其中，曲霉属和毛霉属真菌则可以促进蛋白质分解为游离的氨基酸[17]，促进果蝇的生长发育。但青霉属真菌以及樱桃中产生的6种变形菌门的细菌均是致病菌[18-21]，对果蝇的生长以及樱桃的保存均具有抑制作用，果蝇取食樱桃的后期，微生物数量急剧下降，可能与大量青霉菌和致病细菌的产生有很大关系。同时，该研究中，斑翅果蝇取食过的樱桃中真菌的种类相对较少，说明黑腹果蝇引起樱桃腐烂的速度远高于斑翅果蝇。但是微生物对斑翅果蝇生长发育产生影响的机制则需要进一步的研究和论证。

另外，该研究采用的方法为纯培养的方式，樱桃内的微生物并不能完全被分离和培养出来，目前，宏基因组分类测序方法已经应用于部分昆虫中[22-23]，该技术可以将不同样品中微生物的多样性及其差异进行系统分析，為微生物多样性的研究提供了更精确的方法，因此，将该方法用于研究微生物、昆虫与寄主之间的关系是必然趋势。

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