马齿苋ISSR—PCR反应体系与反应条件的优化

王昭云 那冬晨

摘要 [目的]优化马齿苋ISSR-PCR反应体系与反应条件。[方法]以马齿苋为试验材料，采用改良的CTAB法提取总DNA，对ISSR-PCR引物进行筛选，同时进行ISSR-PCR反应体系和反应条件的优化，电泳检测ISSR-PCR产物。[结果]8个ISSR引物适合马齿苋的ISSR-PCR分析；最适反应体系为总体系25.0 μL，其中2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物2.0 μL，40 mg/L DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL；最适反应条件为94 ℃预变性360 s；

94 ℃变性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30次循环；72 ℃再延伸300 s。[结论]建立了马齿苋ISSR-PCR扩增的最佳反应体系和扩增程序，为进一步研究马齿苋提供基础资料。

关键词 马齿苋；ISSR-PCR；反应体系；反应条件

中图分类号 S647 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0147-02

Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Reaction Condition of Portulaca oleracea L.

WANG Zhao-yun1，NA Dong-chen1，2 *

（1.Modern College of Arts and Sciences，Shanxi Normal University， Linfen，Shanxi 041000；2.College of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen，Shanxi 041000）

Abstract [Objective]To optimize ISSR-PCR reaction system and reaction condition of Portulaca oleracea L.[Method]Taking P.oleracea L.as the research object，using improved CTAB method to extract total DNA of P.oleracea L.，the ISSR-PCR primers were screened，at the same time ISSR-PCR reaction system and reaction condition were optimized to test ISSR-PCR products by electrophoresis.[Result]Eight primers were suitable for ISSR-PCRof P.oleracea L..The optimal reaction system was that total reaction system 25.0 μL，including 12.5 μL 2×Taq Platinum PCR Master Mix，2.0 μL 10 μmol/L primers，1.0 μL 40 mg/L DNA templates，9.5 μL ddH2O.The optimal reaction condition was that pre-degeneration at 94 ℃ for 360 s，going to 30 cycles：degeneration at 94 ℃ for 60 s，annealing at 54 ℃ for 60 s，extension at 72 ℃ for 90 s，then extension at 72 ℃ for 300 s after 30 cycles.[Conclusion]The optimizing ISSR-PCR reaction system and reaction condition of P.oleracea L.were established to provide basis for further study P.oleracea L..

Key words Portulaca oleracea L.；ISSR-PCR；Reaction system；Reaction condition

馬齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科马齿苋属一年生草本植物，药食两用[1]。全株无毛，茎紫红色，圆柱形，平卧或斜倚，伏地铺散，叶互生，有时近对生，叶片扁平，肥厚，倒卵形，顶端圆钝或平截，有时微凹，基部楔形，全缘[2]。马齿苋适应性强，适宜在温暖、湿润、肥沃的壤土或沙壤土中生长，耐旱亦耐涝，生于田野路边及庭园废墟等向阳处，国内各地均有分布。

ISSR是在简单重复序列（SSR）基础上发展起来的新型分子标记，由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等[3]提出。ISSR综合了其他分子标记高多态性、可重复性、低成本、易操作以及无需知道基因组序列等优点[4-5]，现已被广泛应用于鉴定种质、分析遗传关系、构建遗传图谱等研究[6]。该研究以马齿苋为试验材料，对影响ISSR-PCR反应体系的各因素进行优化，建立马齿苋ISSR-PCR扩增的最佳反应体系和扩增程序，为进一步研究马齿苋提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。

马齿苋，采于山西省临汾市汾河公园，该地处于半干旱、半湿润的气候区，属暖温带大陆型气候，冬寒夏热，四季分明，雨热同期。

1.1.2 化学试剂。CTAB、NaCl 、EDTA-Na2·2H2O、Tris、冰乙酸、硼酸、氯仿（三氯甲烷）、异戊醇、无水乙醇、NaOH、HCl（浓）、ddH2O、ISSR引物（20个引物）来自北京奥科生物技术有限责任公司，2×Taq Platinum PCR Master Mix、Gene Green核酸染料、Mark D2000，购自北京天根生化科技有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 总DNA的提取与检测。采用改良的CTAB法提取马齿苋叶片总DNA。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所提总DNA的质量。

1.2.2 ISSR引物。

参考相关的文献资料，初步选取810、823、824、825、826、827、834、835、842、844、847、848、855、857、861、862、864、866、869、870作为候选引物（表1）。

1.2.3 ISSR-PCR反应体系。确定马齿苋ISSR-PCR反应体系，同时对上述20个候选引物进行筛选。反应体系共250 μL：2×Taq Platinum PCR Master Mix 9.0～13.0 μL，引物（10 μmol/L）0.5～2.5 μL，ddH2O 6.5～14.5 μL，DNA（40 mg/L）1.0～3.0 μL。

1.2.4 ISSR-PCR反应条件。

确定马齿苋ISSR-PCR反应条件，反应条件如下：

94 ℃预变性360 s；94 ℃变性60 s，50～56℃退火40～90 s，72 ℃延伸50～100 s，循环30次；72 ℃再延伸300 s。

2 结果与分析

2.1 总DNA的提取

根据马齿苋总DNA电泳图谱可知，提取的DNA完整性好，条带清晰且明亮，没有拖尾和降解的现象，符合PCR扩增的模板要求。

2.2 ISSR-PCR结果

经过反复试验，最终得到马齿苋ISSR-PCR最适反应体系和反应条件。反应体系共25.0 μL：2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA（40 mg/L）1.0 μL。反应条件：94 ℃预变性360 s；94 ℃变性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；72 ℃再延伸300 s。马齿苋ISSR-PCR产物电泳结果见图1。

参考何正文等[7]文献资料，依据谱带的强弱及杂带多少对PCR扩增结果进行分析。从图2可以看出，引物2～9（864、866、869、870、847、848、855、857）的扩增条带稳定，重复性好，特异性好，清晰明亮，861、862等引物的扩增条带出现拖尾现象，条带不清晰，剩余大部分引物的PCR产物电泳结果也均有谱带出现，但条带较弱或重复性不好。

3 讨论与结论

ISSR步骤多、流程长，从DNA提取到引物筛选和PCR反应体系与反应条件的优化，每一步骤都至关重要，是一个多因素影响的综合体系[8]。提取DNA的质量不符合要求，引物、反应体系和反应条件不合适等[9]都可能导致没有条带或条带不清晰、重复性不好等结果。为确保ISSR分析结果的正确性及可重复性，需要对反应体系、反应条件进行优化，并对引物进行筛选[10]。

该试验从以下几方面进行了优化：①总DNA提取的最佳方案。完整、高质量的DNA是获得重复性好、准确可靠的ISSR-PCR结果的保证。文献中有关植物核DNA的提取方法很多，其中以Doyle和Domle（1987年）提出的CTAB法应用最为广泛。改良CTAB法相比传统CTAB法在步骤上有所简化，所得到的基因组DNA纯度高，蛋白质、酚类及多糖等杂质去除较完全，其纯度和浓度均达到了ISSR-PCR反应的要求[11]。

②最佳反应体系。该试验优化所得马齿苋ISSR-PCR的反应体系如下：总反应体系为25.0 μl，其中2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA（40 mg/L）1.0 μL。③最佳反应条件。该试验优化所得马齿苋ISSR-PCR的反应条件为预变性94 ℃ 360 s；94 ℃变性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃ 延伸90 s，30次循环；72 ℃再延伸300 s。

试验结果表明：筛选的8个ISSR引物、优化的反应体系和反应条件适于马齿苋ISSR-PCR分析及相关分子生物学研究。

参考文献

[1] 崔国静，杨祎，贺蔷.马齿苋的来源与功效[J].首都医药，2013（23）：41-42.

[2] 周满生，徐菁，王国华.值得推广的特色蔬菜——马齿苋[J].现代园艺，2013（9）：33-34.

[3] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20（2）：176-183.

[4] AGA E，BEKELE E，BRYNGELSSON T.Inter-simple sequence repeat（ISSR）variation in forest coffee trees （Coffea arabica L.）populations from Ethiopia [J].Genetica，2005，124（2）：213-221.

[5] SYAMKUMAR S，SASIKUMAR B.Molecular marker based genetic diversity analysis of Curcuma species from India [J].Scientia horticulturae，2007，112（2）：235-241.

[6] 趙谦，杜虹，庄东红.ISSR分子标记及其在植物研究中的应用[J].分子植物育种，2007，5（S1）：123-129.

[7] 何正文，刘运生，陈立华，等.正交设计直观分析法优化PCR条件[J].湖南医科大学学报，1998，23（4）：403-404.

[8] 金凤，陈崇顺，邹爱兰，等.月季ISSR反应体系的优化[J].江苏农业科学，2006（1）：72-75.

[9] 刘美，赵桂琴，刘欢，等.早熟禾ISSR反应体系的优化[J].中国草地学报，2009，31（5）：107-111.

[10] BAO R，HU Y P，WANG L，et al.Optimization of ISSR-PCR system and primer screening for Blysmus sinocompressus[J].Chin J Grassland，2014，36（6）：46-52.

[11] 沙伟，滕兆岩，倪红伟.正交设计优化星星草ISSR-PCR反应体系研究[J].中国草地学报，2006，28（6）：52-55.