植物基因功能验证技术概述

杨诗怡 周小利 陈志芸

摘要 随着生物学研究在分子水平上的不断深入和推进，越来越多的基因得以发现并成功克隆，对基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容。植物中存在的众多基因发挥着不同的作用，控制着不同的合成途径，基因各自发挥的功能对植物起着至关重要的作用。总结了有关基因功能验证技术方面的研究，并将常用于验证基因功能的方法做一归纳，以便为后续的试验研究提供生物学基础。

关键词 验证；植物；基因；功能；技术

中图分类号 S188+.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0136-05

Abstract With the development and propulsion of biology at the molecular level， more and more genes were found and cloned successfully， the study of gene functions was increasingly important， it also was an important content of functional genomics in the postgenome era. There were a lot of genes playing different roles in plants， controlling the different routes of synthesis， the function of each gene played a crucial role to planting.This paper summarized the research on the technologies which verify the function of genes，and generalized about the usually used methods，in order to provide a biological basis for subsequent experimental study.

Key words Validation；Plant；Gene；Function；Technology

基因组学是一门重要的科学，主要作用是对所有基因进行基因组作图、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析，目的在于全面探究某个生物种的所有基因，以及所有基因产物构成的生理结构和生命活动[1]。基因组研究发展主要包括结构基因组学和功能基因组学。结构基因组学主要是通过建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱以达到全基因组测序的目标[2]。功能基因组学利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，以功能鉴定为目标，代表基因分析的新阶段[3-4]。功能基因组学常常被称作后基因组学，主要对相关基因功能进行分析，使生物学对单一基因或单一蛋白质的研究转向对多个基因或多个蛋白质的研究，达到同时进行全面研究的有效手段，其研究内容涵盖基因功能发现、基因表达分析和突变检测[5-6]。近年来，越来越多物种的基因组测序工作完成，标志着生命科学研究已迈入功能基因组时代。基因功能研究的重要性日益凸显，众多新基因的功能有待分子生物学家鉴定[7]。正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）是基因组研究的主要方法。正向遗传学是通过突变表型及其遗传规律克隆得到相关基因，确认其在染色体上的位置并进一步确定基因功能[8]，主要的技术手段是通过筛选天然或人工诱导的突变体，以此克隆目标基因，从而得到有相关功能的基因，研究自发或诱发突变体中某一突变性状的遗传行为是正向遗传学的主要功能[9]。反向遗传学是指依照突变基因的已知序列研究基因功能，运用反向遗传学方法鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求[10-11]。

前人在基因功能验证技术方面做了大量的研究及探索，包括过表达、RNA干扰和反义技术、插入突变、基因的定点诱变、基因转导技术、基因敲除技术、基因陷阱、人工染色体转导、基因诱捕技术等，该研究旨在归纳和总结植物基因功能研究的方法和研究进展，为后续深入开展植物基因功能验证提供依据和参考。

1 过表达（Over expression）

过表达是指融合目的基因的全长序列与启动子，通过遗传转化技术，获得该基因产物大量积累的生物体，从而增加此基因在生理生化进程中的效应，并通过这效应引发的与正常植株在表型上的一系列差异来理解基因功能[12]。

基因过表达主要包括两个步骤：过表达载体的构建以及过表达的实现，即通过转基因手段使目的基因在转化植株中实现过表达[13]。目前常用的过表达载体可分为组成型和诱导型[14]。通过这种方法，已成功探究出植物中众多基因的功能，比如将逆境应答信号途径中的基因转化到植物，可通过转化植物之间的表型差异来鉴定其基因功能，同时，逆境应答信号途径的基因转入植物后，能够提高植物的抗逆性，更有助于遗传相关基因的改良[15]。

2 RNA干扰和反义技术

研究植物基因功能的重要前提之一即是获得突变体，而抑制相关基因的表达则是获得突变体的一个有效途径[16]。其中，RNA干扰和反义RNA是两种代表性方法。

2.1 RNA干扰（RNA interference，RNAi）

双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象就是RNA干扰[17]。由于发夹状RNA或21～23 nt的ds RNA与特异性 mRNA结合后，将导致靶基因降解，从而造成目的产物表达的下调，是一种转录后基因沉默机制[18-21]。其作用分為起始阶段、效应阶段和级联放大阶段。近年来，RNAi以其高特异性、高效性等优势已发展为研究基因功能的重要手段，作为生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制，其在稳定基因组方面发挥了巨大作用[22]。

2.2 反义技术

反义技术是指根据碱基互补原理，通过利用人工或生物合成的特异互补的DNA或RNA片段，抑制目的基因表达[23]。包括反义寡核苷酸技术、反义RNA技术和核酶技术。

2.2.1 反义寡核苷酸技术（Antisense oligonucleotides，ASON）。

ASON是用一段人工合成的能与DNA或RNA互补结合的寡核苷酸链抑制基因表达，寡核苷酸片段长度多为15～30 nt，在碱基互补原理的过程中，通过调节基因的解旋、复制、转录以及mRNA的剪接与加工各个环节，达到影响基因输出和翻译的效果，从而调节细胞的生长、分化等[24]。根据结合部位的不同分为反义DNA、反义RNA、自催化性核酶。ASON一般有两方面的作用，一方面是与细胞核内的DNA互补杂交，形成三股螺旋结构，从而抑制DNA的转录；另一方面是与细胞质中的mRNA结合，不仅抑制mRNA的翻译，而且形成能被核糖核酸酶H（RNase H）降解的RNA-DNA双链结构，中断了核糖体对mRNA的翻译，达到抑制基因表达的效果[25]。

2.2.2 反义RNA技术（Antisense RNA）。

能与靶RNA互补配对的小分子RNA被称为反义RNA，可被用于某一段DNA片段功能的定点分析[26]。原理是通过构建人工表达载体，利用基因重组技术，使在离体或体内表达的反义RNA与靶mRNA结合形成较稳定的二聚体，导致靶基因的表达受到抑制，可在DNA的复制、转录及翻译水平上使靶基因表达受到抑制[27]。能直接观察到该基因在植物中的功能是反义RNA技术最突出的优点。

2.2.3 核酶技术（Ribozyme）。

核酶又被称为基因剪刀，能通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA分子，且具有催化活性[28]。核酶自身具有较稳定的空间结构，从而使其不易受RNase攻击，而且单个核酶分子可以结合多个mRNA分子，使mRNA分子在需要剪切的特定部位断裂，所以其催化效率高于反义RNA[29]。核酶常见的有锤头状、发夹状和斧头状，锤头状核酶是目前应用最多的一种核酶。核酶主要由两部分组成：中间极为保守的核苷酸序列和两端的引导序列，当引导序列与靶RNA互补结合时，中间极端保守序列将在该特定位点切断[28]，但也有人认为核酶的原理是反义抑制和切割活性的综合作用结果[30]。

3 插入突变

插入突变是将外源已知的插入元件随机插入到植物基因组中，产生插入突变体，造成插入位点的变化而影响其正常表达，从而导致植株在表型上的变化，并以此插入元件为标记，就能分离和克隆因插入而失活的基因，对该基因进行反向和正向遗传学研究[31]。常用的获得植物中相关基因突变库的方法包括自发突变、物理化学诱变法、T-DNA插入诱导法以及转座子和逆转录转座子法。插入突变的方法不用首先确定基因的表达和基因的产物，通过已知的插入序列作为标记，就能够对未知基因进行研究[32]。由于前述优点，插入突变已经成为对未知基因进行功能鉴定及研究的首选方法之一。

目前，拟南芥、玉米、矮牵牛中已有大量可用的突变体群体，水稻的插入突变群体也正在逐渐扩充完善[33]。以T-DNA、转座子及质粒介导的插入突变等构建突变库，是利用插入突变进行功能基因组学研究的主要方法。对于大规模的植物基因功能分析来说，目前使用最多的是T-DNA或转座子的方法[32，34]。

3.1 T-DNA插入突变

T-DNA插入突变对于正向遗传学和反向遗传学的研究极其方便[35]。植物病原细菌根癌农杆菌的Ti质粒上有一段T-DNA，在病原菌致病过程中，它极易并稳定整合到植物基因组中稳定表达[36]。以农杆菌介导的T-DNA插入突变适用于多种植物，不仅插入位点的随机性比较强，且能直接在植物基因组DNA中产生稳定的插入突变[37]。此方法的缺点是只适合易被T-DNA转化的植物，T-DNA边界的质粒序列可随着T-DNA整合到基因组DNA中，并出现由于整合引起的各种染色体重排现象，从而造成突变表型与T-DNA插入无关[38]。

3.2 转座子插入突变

转座子是能够被一些未知的信号激活，从染色体DNA上的一个基因座转移到另一个基因座的一段可以移动的DNA片段。当转座子插入到一个功能基因时，能起到开关的作用，从而影响其基因的表达，将会导致暂时性的突变，部分转座子由于丧失从染色体上隔离出来的能力，将会变为永久性的突变[39]。转座子插入突变的优点是其能造成突变体反转，基于此可进一步确认表型是否由转座子插入突变引起[40]。

4 基因的定点诱变

定点诱变（Sitedirected mutagenesis）是指取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基，它是基因工程和蛋白质工程的重要手段，有简单易操作、重复性高等优点，已经被广泛应用于基因表达调控及其结构与功能以及蛋白质性质等诸多研究领域[41-42]。其中化学诱变法、寡核苷酸介导的诱变法、盒式诱变法和基于PCR诱变法是最常用的方法。

4.1 PCR介导的定点诱变

聚合酶链式反应（PCR）是一种对特定DNA序列进行体外快速扩增的技术手段。到目前为止，重组PCR法、重叠延伸法、含U模板法和大引物突变等方法都是利用PCR进行定点突变的方法[43-45]。其中，重叠延伸突变法和大引物突变法应用更为广泛，但这些方法都具有操作较复杂、步骤较繁琐的缺点，需要多轮PCR和多个引物来完成突变，而且得到的非目标突变率较高[46-47]。

4.2 盒式诱变（Cassette mutagenesis）

盒式诱变就是通过一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片断，去代替野生型基因中的对应序列。其方法步骤是先将目的基因克隆到适合的载体上，然后用定向诱变的方法，在准备诱变的目的密码子两侧各引入1个单酶切位点，连接到同一载体上，再将此載体用新引进的2个酶切位点切开使其成线型，最后连接人工合成的、只有目的密码子发生了变化的双链DNA诱变和线型载体，转化筛选目的突变子[48]。

4.3 寡核苷酸介导的诱变（Oligonucleotidedirected mutagenesis）

利用人工合成的少量密码子发生变化的寡核苷酸，介导得到诱变目的基因的方法称为寡核苷酸介导的诱变[49]。其步骤是首先将待突变基因克隆到M13噬菌体上，然后转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌感受态细胞后，就会产生野生型、突变型的同源双链DNA分子，初步筛选突变基因的方法主要是限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法[49-50]。

4.4 CRISPR系统

目前，基因组靶向修饰技术主要涉及锌指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs ）、TALE核酸酶（Transcription activator like effective nucleases，TALENs ）以及近两年迅速崛起的CRISPR/Cas9技术。ZFNs融合含有ZFA和FOKⅠ，其中ZFA是一种串联锌指DNA结构域的转录因子蛋白，FOKⅠ是一种非特异性的核酸内切酶[51]；TALENs 是TAL效应子与 FOK Ⅰ融合而成[52]。上述两者均能特异性地识别并结合指定的DNA序列，形成有切割活性的FOK Ⅰ二聚体，在靶位点断裂DNA双链。其中，TALENs能不受前后两端基因的影响去识别任意目标基因序列，且脱靶效应少；TALENs与ZFNs只能成为常规基因组编辑工具的原因在于它们都只针对不同靶点改变碱基识别序列，除此以外，TALENs与ZFNs的合成或组装不仅耗时费力而且费用昂贵[52]。

CRISPR系统是一种为细菌提供获得性免疫的Ⅱ型系统，近年，通过对CRISPR系统加以研究改造，创造出了CRISPR/Cas9技术，一种第三代基因组靶向修饰技术，该系统与传统基因修饰技术不同在于CRISPR/Cas9系统仅需改变很短的RNA序列便可引导 Cas9 蛋白特异性地对靶基因进行编辑。除此之外，CRISPR系统在细菌体内广泛存在。由于真核生物中不具备CRISPR系统这样的特征，从而避免了该技术在应用过程中与真核细胞内源性核酸内切酶途径形成竞争[53]。这种新的基因组定点编辑技术具有比TALENs和锌指核酸酶ZFNs技术设计更简单、更易操作的优势[54]。

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas system）是细菌和古细菌具备的获得性免疫系统，主要用来防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA的侵染[55]。此系统主要由Cas9核酸酶和cr RNA所组成，前者是一种非特异性的核酸酶，后者则主要起识别作用[56]。

CRISPR/Cas系统被分为3类，分类依据主要是通过Cas蛋白的种类和同源性，其中需要多种Cas蛋白参与的是Ⅰ类和Ⅲ类，Ⅱ型系统主要依赖的是Cas9核心蛋白，组分较简单，在RNA的介导下，Cas9蛋白能够切割靶序列，引起DNA的双链断裂（Doublestrand breaks，DSB）。在这个基础上，可以实现对基因组特定位点进行基因打靶、基因定点插入、基因修复等各项遗传操作[54]。但是，CRISPR/Cas系统也有一些缺陷，如进入细胞后可能脱靶，即在非目标位点进行酶切[57]。为了降低脱靶现象的发生，第一种方法是可以通过降低Cas9/sgRNA的浓度，但同时也会导致基因编辑的效率降低；第二种方法是将转录的sgRNA与Cas9重组后直接注入细胞以达到减少脱靶现象发生的目的[53]。

5 基因转导技术

基因转导技术是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法，它是指将目的基因转导进入某一细胞中，然后通过观察细胞生物学行为的变化来认识基因的功能[58]。因为基因表达受到转导效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响，所以选择转导系统需十分小心谨慎[59]。非病毒性表达系统和病毒性表达系统是常用的两种基因转导系统[60]。

5.1 非病毒性表达载体

非病毒性表达载体主要是通过与多聚赖氨酸、阳离子脂类混合或者是DNA直接注射的途径，达到使目的基因穿过细胞膜的作用[60]。选择表达载体时应选择强启动子和增强子、高效的多聚腺苷酸加尾信号（PolyA）、内含子序列以及内部核糖体进入位点（IRES）[59]。

5.2 病毒表达载体

由于以病毒为载体介导的基因转移有许多优点，诸如转染效率高、目的基因能够稳定表达，所以得到了广泛的应用，主要包括物理、化学和生物方法。物理方法主要包括DNA直接注射法和轰击颗粒技术；化学方法包括脂质体载体和受体介导法；构建病毒载体属于生物学的方法[59]。目前构建的病毒载体多种多样，但是它们都具备自身的特点，逆转录病毒载体能够将外源基因携带着并将其整合进靶细胞的基因组中，因而实现了目的基因稳定地持久性表达的优点，但其也有缺点，如只能感染正在分裂的细胞，且繁殖的病毒悬液浓度较低，而且有插入突变和激活癌基因的危险[28，61]。人腺病毒载体具有宿主范围广、滴度高、装载量大等优点，是一种对分裂细胞和静息细胞都有效的基因传递系统[61]。

6 基因敲除技术

利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组[62]，置换出具有功能的同源序列，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除[63]。这项技术具有较多的优点，如整合位点精确、转移基因频率较高，既能用正常基因敲除突变基因，以进行性状的改良和遗传病的治疗，也可以用突变的基因敲除正常的基因，以达到研究此基因功能的目的[64]。

置换型载体也是进行基因敲除的常用方法，即造成內源基因一个功能片段被正向选择基因所置换，形成基因的缺失突变，即将正向选择基因插入内源基因的功能区域后造成插入突变[65]。

[8] 崔兴国.植物功能基因组学及其研究技术[J].衡水学院学报，2007，9（1）：23-26.

[9] 王景雪，孙毅，徐培林，等.植物功能基因组学研究进展[J].生物技术通报，2004（1）：18-22.

[10] 杨宇，王丹，李浩戈.反向遗传学在现代生物学领域中的应用[J].生物技术通报，2009（5）：43-45.

[11] 彭陈，王瑞，李万昌，等.植物基因功能研究新方法[J].华北农学报，2014，29（1）：109-113.

[12] 杜玉梅，左正宏.基因功能研究方法的新进展[J].生命科学，2008，20（4）：589-592.

[13] 王景晨.水稻Hsp74.8基因的初步功能研究和两个水稻MYB基因的过表达载体构建[D].长沙：湖南农业大学，2011.

[14] 杨志如，云锦凤，魏建华，等.诱导型和组成型表達的冷诱导转录因子CBF1基因表达载体的构建[J].华北农学报，2009，24（3）：41-45.

[15] 黄越敏.水稻逆境相关基因的遗传转化和功能鉴定[D].武汉：华中农业大学，2006.

[16] 陶彦彬，蒋建雄，易自力，等.功能基因组学及其研究方法[J].生物技术通报，2007（5）：61-64.

[17] 贾朔，赵玲玲.RNA干扰及其应用研究进展[J].农家科技，2016（10）：82.

[18] HANNON G J.RNA interference[J].Nature，2002，418（6894）：244-251.

[19] CHANG H.RNAimediated knockdown of target genes：A promising strategy for panereatic cancer research[J].Cancer gene therapy，2007，14（8）：677-685.

[20] ELBASHIR S M，HARBORTH J，LENDECKEL W，et a1.Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature，2001，411（6836）：494-498.

[21] 李丽文，朱延明，李杰，等.RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展[J].东北农业大学学报，2007，38（1）：119-124.

[22] 肖倩，孙晓宁.RNA干扰在生物基因治疗中的应用及意义[J].中南医学科学杂志，2015（1）：95-97.

[23] 柴晓杰，王丕武，关淑艳，等.反义技术及其在植物基因工程中的应用[J].吉林农业大学学报，2004，26（5）：515-518.

[24] 林静.反义核酸技术及其应用[J].湖北理工学院学报，2010，26（2）：46-48.

[25] 吕艳秋，石刚刚.反义寡核苷酸技术研究进展[J].广东医学，2006，27（8）：1270-1272.

[26] 赵先萍.功能基因组学的研究方法及发展前景[J].中国畜禽种业，2015（12）：83.

[27] 王伏林，王远山，胡张华.反义RNA在植物基因工程中的应用[J].生物技术，2003，13（1）：34-35.

[28] 纪宗玲，刘继中，陈苏民.基因功能的研究方法[J].生物工程学报，2002，18（1）：117-120.

[29] FEDOR M J.Structure and function of the harpin ribozyme[J].Journal of molecular biology，2000，297（2）：269-291.

[30] 侯化，金由辛.核酶在基因治疗中的研究进展[J].现代诊断与治疗，2000，11（3）：152-154.

[31] 赵霞，周波，李玉花.T-DNA插入突变在植物功能基因组学中的应用[J].生物技术通讯，2009，20（6）：880-884.

[32] 孟凡立，张卫国，陈庆山.插入突变在功能基因组学研究中的应用[J].生物信息学，2006，4（1）：38-40.

[33] 江树业.水稻突变群体的构建及功能基因组学[J].分子植物育种，2003，1（2）：137-150.

[34] 侯雷平，李梅兰.T-DNA标签在植物基因克隆和功能分析中的应用[J].西北植物学报，2006，26（5）：1066-1070.

[35] 王凤华，李光远.T-DNA插入突变及其研究进展[J].河南农业科学，2007，36（6）：12-14.

[36] JEON J，LEE S，JUNG K H，et al.TDNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice[J].Plant journal，2000，22（6）：561-570.

[37] GYNHEUNG A.Rice functional genomics by T-DNA insertional mutagenesis[J].Asia pacific biotech news，2011，6（24）：926-929.

[38] 高俊平.T-DNA插入突变体在植物基因功能分析中的应用[J].山西青年，2013（9）：228.

[39] 李宏.转座子标签在植物基因组学研究中的应用[J].安徽农业科学，2009，37（2）：527-528.

[40] 马艳平，刘永生，张杰，等.转座子应用的研究进展[J].江西农业学报，2009，21（5）：108-110.

[41] 王秋颖.基因体外定点诱变技术[J].山西农业大学学报，2007，27（6）：124-126.

[42] 马强.功能基因组学研究进展[J].东方教育，2015（5）：1-2.

[43] VILCHIS F，VALDEZ E，RAMOS L，et al.Novel compound heterozygous mutations in the SRD5A2 gene from 46，XY infants with ambiguous external genitalia[J].Journal of human genetics，2008，53（5）：401-406.

[44] BINAY B，KARAGULER N G.Attempting to remove the substrate inhibition of Llactate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus by sitedirected mutagenesis[J].Applied biochemistry and biotechnology，2007，141（2/3）：265-272.

[45] ANGELACCIO S，BONACCORSI DI PATTI M C，et al.Sitedirected mutagenesis by the megaprimer PCR method：Variations on a theme for simultaneous introduction of multiple mutations[J].Anal Biochem，2002，306（2）：346-349.

[46] 雒丽娜，王盛，王玉炯.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究[J].安徽农业科学，2012，40（10）：5779-5781.

[47] 张碧乾，邓会群，宫彩霞，等.大引物PCR定点突变方法的改进[J].湖北大学学报（自然科学版），2009，31（1）：79-81.

[48] 刘玉冰，李晓霞，王宝利，等.一步PCR法在单碱基定点诱变中的应用[J].天津医科大学学报，2007，13（1）：98-99.

[49] 崔行，王明运.寡核苷酸介导的DNA定位诱变技术的进展[J].生命的化学，1992（2）：18-21.

[50] 董慧青.一种寡核苷酸介导的大肠杆菌基因敲除或点突变的方法[D].南京：南京师范大学，2011.

[51] KIM Y G，CHA J，CHANDRASEGARAN S.Hybrid restriction enzymes：Zinc finger fusion to FokI cleavage domain[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（3）：1156-1160.

[52] CHRISTIAN M，CERMAK T，DOYLE E L，et al.Targeting DNA doublestrand breaks with TAL effector nucleases[J].Genetics，2010，186（2）：757-761.

[53] 周亞兰，宗亚楠，孔祥东.第三代基因组编辑技术：CRISPR/Cas9的研究进展[J].中华医学遗传学杂志，2016，33（5）：713-716.

[54] 李聪，曹文广.CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J].生物工程学报，2015，31（11）：1531-1542.

[55] 骞蕾阳，周志军，常岩林.新型基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究现状[J].河北大学学报（自然科学版），2016，36（1）：84-93.

[56] 宋丽杰，王丽，王捷.CRISPR/Cas9：一种新型的基因组定点编辑技术[J].生命科学研究，2015（3）：276-282.

[57] MALI P，YANG L，ESVELT K M，et al.RNAguided human genome engineering via Cas9[J].Science，2013，339（6121）：823-826.

[58] 王雪颖，米丽娜，杨铮，等.基因功能的研究方法[J].中国疗养医学，2017，26（2）：131-133.

[59] 李新枝，蔡佩玲，牟林春.基因功能研究的方法[J].四川解剖学杂志，2007，15（1）：57-59.

[60] 蔡晓军.阳离子聚赖氨酸衍生物非病毒基因载体的设计与构建[D].上海：同济大学，2013.

[61] 卜友泉，杨正梅，宋方洲.新基因功能研究的策略与方法[J].生命科学研究，2006（S1）：96-99，108.

[62] 陈莹，彭晓珏，官杰，等.植物基因打靶技术及其应用[J].热带亚热带植物学报，2012，20（6）：642-648.

[63] 贺松，张德纯.基因敲除方法及其应用[J].中国微生态学杂志，2009，21（2）：181-184.

[64] 刘建密，邵铁梅，李国勋，等.微生物基因敲除技术的研究进展[C]//中国植物保护学会2006年学术年会.昆明：中国植物保护学会，2006.

[65] 陶果，信吉阁，肖晶，等.基因敲除技术最新研究进展及其应用[J].安徽农业科学，2013，41（29）：11605-11608，11644.

[66] 呂飞.浅谈“基因敲除”[J].生物学教学，2010，26（9）：8-9.

[67] 周维，付喜爱，张德显，等.基因敲除技术的研究进展[J].中国兽医杂志，2015，51（3）：67-69.

[68] 王飞，王宁.基因敲除技术的发展概述[J].雅安职业技术学院学报，2015（3）：17-19.

[69] 李今煜，陈健铭，彭振坤.几种常用的基因敲除技术[J].武夷科学，2007，23（1）：187-190.

[70] 陈其军，肖玉梅，王学臣，等.植物功能基因组研究中的基因敲除技术[J].植物生理学报，2004，40（1）：121-126.

[71] SPRINGER P S.Gene traps：Tools for plant development and genomics[J]. Plant cell，2000，12（7）：1007-1020.

[72] 高泽发，陈绪清，杨凤萍，等.植物功能基因组研究方法及进展[J].生物学杂志，2005，22（6）：1-4.

[73] 赵家评，程汉，王君晖.植物功能基因组学手段[J].绍兴文理学院学报，2003，23（7）：71-74.

[74] LAMB B T，GEARHART J D.YAC transgenics and the study of genetics and human disease[J].Current opinion in genetics & development，1995，5（3）：342-348.

[75] 李林川，韩方普.人工染色体研究进展[J].遗传，2011，33（4）：293-297.

[76] 谭晓红，程萱，毛春明，等.利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除的初步研究[J].生物化学与生物物理进展，2004，31（7）：606-610.

[77] EVANS M J，CARLTON M B，RUSS A P.Gene trapping and functional genomics[J].Trends in genetics，1997，13（9）：370-374.

[78] TAKEUCHI T.A gene trap approach to identify genes that control development[J].Development growth & differentiation，1997，39（2）：127-134.

[79] 刘楠梅.基因功能研究方法浅介[J].生物技术通讯，2000，11（3）：231-233.

[80] MEISSNER R，CHAGUE V，ZHU Q，et al.A high throughput system for transposon tagging and promoter trapping in tomato[J].Plant J，2000，22（3）：265-274.

[81] JEONG D H，AN S，KANG H G，et al.TDNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice[J].Plant Physiol，2002，130（4）：1636-1644.