斑石鲷卵鞭虫病病原的分子鉴定与系统发育分析

付泉洁 范超 谢国驷 叶仕根 史成银

摘要 [目的]对严重危害斑石鲷鱼苗的卵鞭虫病病原——渤海分离株（Bohai-1407 isolate）进行分子生物学鉴定和系统发育分析。[方法]设计4对特异性引物，应用PCR方法克隆并测定渤海分离株的核糖体DNA（rDNA）序列；应用Blast比對分析渤海分离株rDNA的结构；依据rDNA序列，分别构建10种胚沟科鞭毛虫和19株眼点淀粉卵涡鞭虫分离株/克隆的系统发育树，分析渤海分离株的系统分类地位。[结果]扩增出了渤海分离株的4个DNA片段，拼接出长度为6 530 bp的rDNA操纵子序列；该操纵子由74 bp的部分外转录间隔区（ETS）、1 813 bp的小亚基（SSU）、352 bp的内转录间隔区1（ITS1）、159 bp的5.8S、698 bp的内转录间隔区2（ITS2）和3 388 bp的大亚基（LSU）串联而成，3′端还有46 bp的部分非转录间隔区（NTS）；渤海分离株与眼点淀粉卵涡鞭虫宁德株（Ningde1412）的rDNA序列相似性高达99.5%；依据SSU序列建立了包含10种胚沟科鞭毛虫的系统发育树，渤海分离株与世界各地分离到的眼点淀粉卵涡鞭虫聚类在一起，将其鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫；依据ITS1和ITS2序列建立了包含19株眼点淀粉卵涡鞭虫的2个系统发育树，渤海分离株与从美国弗罗里达盐水池塘中分离到的墨西哥湾分离株FL_21（DQ490260.1）总是聚类在一起。[结论]斑石鲷卵鞭虫病的病原——渤海分离株可以鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫，该分离株与墨西哥湾分离株FL_21的亲缘关系最近。

关键词 斑石鲷；眼点淀粉卵涡鞭虫；核糖体DNA；分子鉴定；系统发育分析

中图分类号 S941.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0135-06

Molecular Identification and Phylogenetic Analysis of a Pathogenic Dinoflagellate Isolated from Spotted Knifejaw （Oplegnathus puncatus）

FU Quan-jie1， 2， FAN Chao2， 3， XIE Guo-si2， SHI Cheng-yin2* et al

（1. College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian， Liaoning 116023；2. Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control， Ministry of Agriculture， Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao， Shandong 266071；3. College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract [Objective] A pathogenic dinoflagellate （the Bohai-1407 isolate） was isolated from diseased Oplegnathus puncatus. To perform molecular identification and phylogenetic analysis of the Bohai-1407 isolate. [Method] Four pair of specific PCR primers were used to amplify the ribosomal DNA （rDNA） fragments of the Bohai-1407 isolate. The rDNA fragments were cloned and sequenced. The sequences of cloned rDNA fragments were assembled and then analyzed by Blast. The systematic taxonomy of the Bohai-1407 isolate was analyzed by constructed phylogenetic trees based on the rDNA sequences of 10 dinoflagellates in family Blastodiniidae and the rDNA sequences of 19 isolates/clones in species Amyloodinium ocellatum. [Result] Four ribosomal DNA （rDNA） fragments of the Bohai-1407 isolate were amplified. Sequence analysis showed that the sequenced rDNA operon were 6 530 bp in length. The rDNA operon was composed of 74 bp of partial external transcribed spacer （ETS）， 1 813 bp of 18S （also called small subunit， SSU）， 352 bp of internal transcribed spacers 1 （ITS1）， 159 bp of 5.8S， 698 bp of internal transcribed spacers 2 （ITS2） and 3388 bp of 23S （also called large subunit， LSU）， followed by a 46 bp of partial non-transcribed spacer （NTS） in the 3 end. The sequence identity between the Baohai-1407 isolate and the Ningde1412 strain of A. ocellatum was as high as 99.5%. Based on the SSU sequence of 10 dinoflagellates in family Blastodiniidae， a phylogenetic tree was constructed and the Bohai-1407 isolate clustered with isolates of A. ocellatum. Two phylogenetic trees based on the ITS1 and ITS2 sequences of 19 isolates/clones in species A. ocellatum were also constructed. The Bohai-1407 isolate always clustered with the Gulf of Mexico isolate FL_21 （DQ490260.1）. [Conclusion] The pathogenic dinoflagellate （the Bohai-1407 isolate） isolated from diseased O. puncatus was A. ocellatum according to the molecular identification results of rDNA. The Bohai-1407 isolate was most closely related to the Gulf of Mexico isolate FL_21 of A. ocellatum.

Key words Oplegnathus puncatus；Amyloodinium ocellatum；rDNA；Molecular identification；Phylogenetic analysis

斑石鲷（Oplegnathus puncatus）是一种具有较高经济价值的海水鱼类，其抗逆性强，生长迅速，营养价值高，具有良好的发展前景。2014年斑石鲷的规模化人工繁育在我国获得成功。因养殖时间较短，目前国内对其病害的报道较少。2014年夏季在山东某斑石鲷育苗场，多个养殖池的斑石鲷幼鱼突然发病，3 d之内全部死亡。通过病理切片、病原形态的光镜和电镜观察，初步判断该病为斑石鲷卵鞭虫病[1]，其病原为眼点淀粉卵涡鞭虫，命名为渤海分离株（Bohai-1407 isolate）。

眼点淀粉卵涡鞭虫（Amyloodinium ocellatum）有时也被称为淀粉卵甲藻，是一种鞭毛虫类的原生动物，在动物分类系统中属于植鞭纲（Phytomastigophora）腰鞭目（Dinoflagellida）胚沟科（Blastodiniidae）。眼点淀粉卵涡鞭虫是常见的鱼类寄生虫之一，能导致养殖鱼类大量死亡，是重要的海洋鱼类病原之一[2]。其生活史包括3个阶段：营养体阶段、分裂前体阶段、涡孢子阶段。营养体用假根状的凸起附着在鱼体的鳃和皮肤上[3]。环境条件适宜时，该寄生虫可快速分裂繁殖，几天内即可造成养殖及观赏鱼大量死亡[4-7]。该寄生虫分布范围广，在太平洋、大西洋、墨西哥湾、红海、地中海等海域均有发现；其宿主范围广泛，可感染20多种经济鱼类[8]。

对病原进行准确的鉴定，是有效控制寄生虫病的前提。鉴定卵涡鞭虫的传统方法是通过光镜或电镜观察，依据涡孢子的形态特征或甲壳结构进行判断，但这种方法准确性不高。近年来，许多学者开始通过分子系统发育分析对鞭毛虫进行分类鉴定[9-10]。核糖体RNA是核糖体的重要组分，具有关键的生物学功能，由位于染色体上的核糖体DNA（ribosomal DNA，rDNA）编码。在真核生物基因组中，18S、5.8S和28S rDNA串联在一起，中间被2个内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）隔开。18S rDNA也被称为小亚基rDNA（small subunit rDNA，SSU rDNA），28S rDNA也被称为大亚基rDNA（large subunit rDNA，LSU rDNA）。SSU rDNA已被广泛用于鞭毛虫物种间的分类鉴定，而ITS通常被用于物种内的系统发育分析[9-11]。

国内关于眼点淀粉卵涡鞭虫的研究较少，且多集中在防治方面[12-15]，对该病原的分子鉴定和系统发育分析缺乏研究。该研究针对感染斑石鲷的眼点淀粉卵涡鞭虫渤海分离株，测定了其rDNA的序列，依据SSU和ITS序列对其分类地位进行了分子鉴定，探讨了眼点淀粉卵涡鞭虫各分离株的系统发育关系。

1 材料与方法

1.1 材料

取病症严重的濒死病鱼鱼苗，放在培养皿中。用无菌海水轻轻洗脱鱼鳃上附着的寄生虫营养体，使营养体脱落至水中并沉淀。用吸管反复轻轻吸除水中的杂质，直至用显微镜观察几乎看不到杂质。转移底部的营养体至含无菌海水的培养皿中，25 ℃恒温培养，培养至分裂后期加入70%乙醇于-20 ℃保存备用[1]。

1.2 引物设计

参考GenBank中眼点淀粉卵涡鞭虫的rDNA序列设计4对PCR引物，引物序列见表1。4对引物扩增的PCR产物前后衔接且有部分重叠，最后可以拼接成完整的rDNA序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 渤海分离株DNA的提取与rDNA的PCR扩增

取保存的眼点淀粉卵涡鞭虫，用天根生化科技（北京）有限公司的海洋生物组织DNA提取试剂盒制备PCR模版，具体操作依据试剂盒说明书进行。采用50 μL体系进行PCR扩增：10×Taq Buffer 5 μL，5 U/μL 的Taq DNA聚合酶0.25 μL，2 mmol/L的dNTP Mix 4 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL，10 μmol/L正反向引物各2 μL，DNA模板1.5 μL，加ddH2O至50 μL。反應条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取产物10 μL，用2%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果并拍照。

1.4 扩增产物的克隆、测序和序列分析

使用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T5 Zero Cloning Kit试剂盒对PCR扩增产物进行克隆，具体操作依据试剂盒说明书进行。将阳性克隆菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，用DNAMAN 8软件对测序结果进行拼接，用Blast程序对拼接的序列在线分析和序列比对。

1.5 眼点淀粉卵涡鞭虫的分子鉴定和系统发育分析

从GenBank中下载有代表性的9种胚沟科鞭毛虫的SSU序列，与拼接后得到的渤海分离株SSU序列一起（表2），用Mega 6.0软件构建最大可能性法（Maximum Likelihood）系统发育树，分析渤海分离株在胚沟科鞭毛虫中的分类地位。从GenBank中下载18个眼点淀粉卵涡鞭虫分离株/克隆的ITS序列，与拼接后得到的渤海分离株ITS序列一起（表3），用Mega 6.0软件构建最大可能性法系统发育树，分析渤海分离株与眼点淀粉卵涡鞭虫各分离株的系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 渤海分离株rDNA的PCR扩增

使用该研究设计的4对PCR引物，成功地从渤海分离株的DNA样品中扩增出4段产物。琼脂糖凝胶电泳结果显示，引物对AO-231F/AO-2934R的PCR产物大小约为2.7 kb，引物对AO-2874F/AO-4961R的PCR产物大小约为2.1 kb，引物对AO-SSU-F/AO-SSU-R的PCR产物大小约为1.4 kb，引物对AO-LSU-F/AO-LSU-R的PCR产物大小约为17 kb（图1），均与预期扩增片段大小相符。

2.2 渤海分离株rDNA的序列分析

将挑选出的阳性克隆进行序列测定，对测序结果进行序列拼接，得到长度为6 530 bp的渤海分离株rDNA序列。分析发现，该序列包含了完整的18S、5.8S、28S rDNA操纵子，由74 bp的部分外转录间隔区（extra transcribed sequence，ETS），1 813 bp的SSU（18S rDNA），352 bp的ITS1，159 bp的5.8S rDNA，698 bp的ITS2和3 388 bp的LSU（23S rDNA）依次串联而成，在3′端还含有46 bp的部分非转录间隔区（non-transcribed spacer，NTS）（图2）。通过Blast比对这一段6 530 bp的序列，发现渤海分离株（Bohai-1407 isolate）与眼点淀粉卵涡鞭虫宁德株（Ningde1412）的序列相似性为99.5%。

2.3 眼点淀粉卵涡鞭虫的系统发育分析

依据SSU序列构建的10种胚沟科鞭毛虫系统发育树见图3。可以看出，渤海分离株（Bohai-1407 isolate）与眼点淀粉卵涡鞭虫各分离株聚类在一起，与胚沟科其他鞭毛虫亲缘关系较远，因此可以将渤海分离株鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫。该发育树还显示，渤海分离株作为一个单独的分支，与其他眼点淀粉卵涡鞭虫分离株所在的分支区别开来。这意味着与其他眼点淀粉卵涡鞭虫分离株相比，渤海分离株的独特性更强。

由于SSU序列变异很小，不适合用于眼点淀粉卵涡鞭虫各分离株的种内分析。因此，该研究依据变异性相对较高的ITS1和ITS2序列，分别构建了包含19个眼点淀粉卵涡鞭虫分离株/克隆的系统发育树。

根据ITS1序列构建的系统发育树见图4。图中显示，19个眼点淀粉卵涡鞭虫分离株/克隆聚类为2个大的分支A和B。大分支A由13个分离株/克隆组成，包含渤海分离株（Bohai-1407）、宁德株（Ningde1412）、1个DC-1克隆（AocITSC 15）、4个红海克隆（Red Sea 2-1、2-5、2-6、2-7）、1个墨西哥湾克隆（FL_21）、2个亚得里亚海克隆（Adriatic Sea 3-4、3-7）、3个地中海克隆（Mediterranean Sea 1-4、2-4、3-1）。渤海分离株与从美国弗罗里达盐水池塘分离到的1个墨西哥湾克隆（FL_21）亲缘关系最近，在大分支A中又聚类为一个小的分支。大分支B由6个克隆组成，包含3个DC-1克隆（AocITSC 6-10-13、3-8-11、18）、1个墨西哥湾克隆（FL_16）、1个亚得里亚海克隆（Adriatic Sea 3-2）和1个地中海克隆（Mediterranean Sea 2-1）。

根据ITS2序列构建的系统发育树见图5。图中显示，19个眼点淀粉卵涡鞭虫分离株/克隆也聚类为2个大的分支A和B。大分支A由10个分离株/克隆组成，包含宁德株（Ningde1412）、4个红海克隆（Red Sea 2-1、2-5、2-6、2-7）、2个亚得里亚海克隆（Adriatic Sea 3-4、3-7）、3个地中海克隆（Mediterranean Sea 1-4、2-4、3-1）。大分支B由9个克隆组成，包含渤海分离株（Bohai-1407）、4个DC-1克隆（AocITSC 6-10-13、3-8-11、15、18）、2个墨西哥湾克隆（FL_16、21）、1个亚得里亚海克隆（Adriatic Sea 3-2）和1个地中海克隆（Mediterranean Sea 2-1）。渤海分离株与从美国弗罗里达盐水池塘分离到的1个墨西哥湾克隆（FL_21）亲缘关系最近，在大分支B中又聚类为一个小的分支。

在上述2个系统发育树中，渤海分离株总是与墨西哥湾株FL_21聚成一个小的分支，表明该渤海分离株与墨西哥湾分离株FL_21的亲缘关系最近。但这个小分支在2个树中的相对位置不同，分别处于不同的大分支上。此外还有1个DC-1克隆（AocITSC 15）在2个树中的相对位置也不同，分别处于不同的大分支上。除上述3个分离株/克隆之外，其余的各分离株/克隆在2个系统发育树中，均处于相同的大分支上，可以明显区分为2个大的类群。

3 讨论与结论

卵鞭虫病是一种在全球范围内广泛流行的鱼类寄生虫病，对鱼苗的致死率高，危害严重。该研究针对新发现的斑石鲷卵鞭虫病，测定了其病原的rDNA序列，应用生物信息学方法对病原进行了分子鉴定，确认其病原是眼点淀粉卵涡鞭虫。该研究结果为有效控制斑石鲷卵鞭虫病提供了重要依据。

真核生物的rDNA已被广泛应用于物种的分类鉴定和系統发育分析[10，16]，眼点淀粉卵涡鞭虫的rDNA序列也已成为病原分子鉴定的重要依据[9，11]。在GenBank中已公开了眼点淀粉卵涡鞭虫10余个分离株/克隆的rDNA序列20余条。然而，除感染大黄鱼的宁德株（Ningde1412，KU761581.1）外，绝大多数分离株/克隆的rDNA序列是不足2 000 bp的短序列，未涵盖完整的SSU和LSU序列。该研究测定了渤海分离株（Bohai-1407 isolate）的rDNA序列，长度达6 530 bp。该序列涵盖了渤海分离株完整的SSU、ITS1、5.8S、ITS2和LSU序列，为深入研究眼点淀粉卵涡鞭虫rDNA的变异提供了参考资料。

比对眼点淀粉卵涡鞭虫渤海分离株与宁德株的rDNA序列，二者的相似性高达99.5%，这表明感染斑石鲷的渤海分离株和感染大黄鱼的宁德株是同一种寄生虫。依据10种胚沟科鞭毛虫SSU序列构建的系统发育树也显示，渤海分离株与世界各地分离到的眼点淀粉卵涡鞭虫聚类在一起。因此，斑石鲷卵鞭虫病的病原可以鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫。

与SSU、5.8S和LSU相比，rDNA中的ITS面对较小的选择压力，因此序列变异更大。在该研究测定的6 350 bp的眼点淀粉卵涡鞭虫rDNA序列中，渤海分离株与宁德株在34个位点处存在差异，ITS1和ITS2分别占10个和16个。因此，ITS更适用于眼点淀粉卵涡鞭虫种内的系统发育分析[18-19]。该研究依据眼点淀粉卵涡鞭虫ITS1和ITS2序列构建的2个系统发育树，其形态基本相同。来自世界不同地域的眼点淀粉卵涡鞭虫19个分离株/克隆，分别处于2个大的分支上，即可以明显区分为2个大的类群。但另一方面，系统发育树也显示，来自同一地域的不同分离株/克隆分散于不同的大类群中。上述研究结果与此前文献的报道基本一致[10-11]。这意味着ITS1和ITS2序列反映的眼点淀粉卵涡鞭虫种内变异与寄生虫的分离地域关系不大。值得注意的是，在依据ITS1和ITS2构建的2个系统发育树中，渤海分离株总是与墨西哥湾株FL_21聚成一个小的分支。但这个小分支在2个树中的相对位置不同，分别处于不同的大分支上。造成这种现象的原因，还有待进一步探讨。

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