蛹虫草菌种退化的检测方法和影响因素

孟小丽 李翠新

摘要 从蛹虫草菌种的退化表现、早期的检测方法、菌种退化的影响因素和退化菌种的复壮等方面对蛹虫草菌种退化进行总结，以期为蛹虫草菌种退化的研究提供新思路。

关键词 蛹虫草；菌种退化；检测方法；影响因素；复壮

中图分类号 S567.3+5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0133-02

Detection Method and Influencing Factors of Strain Degradation of Cordyceps militaris

MENG Xiao-li，LI Cui-xin*

（College of Life Sciences， Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650051）

Abstract The strain degradation of Cordyceps militaris was summarized from the aspects of the degradation performance of strain， the early detection method， the influencing factors of the strain degradation and the strain rejuvenation of Cordyceps militaris，which provides a new idea for the study of the strain degradation of Cordyceps militaris.

Key words Cordyceps militaris；Strain degradation；Detection method；Influencing factors；Rejuvenation

蛹蟲草（Cordyceps militaris），即北冬虫夏草，是虫草属的模式菌，分类学上属于子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌亚纲（Hypocreomycetidae）肉座菌目（Hypocreales）虫草菌科（Cordycipitaceae）虫草属（Cordyceps）[1]。蛹虫草是一种新资源食品，它富含许多种营养与活性成分，其中有虫草素、虫草酸、多种人体必需氨基酸、微量元素、维生素、虫草多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等[2-3]，这些活性成分使得蛹虫草具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤以及提高人体免疫力的功效[4-5]。蛹虫草和冬虫夏草是同属异种的食药用真菌，有研究表明，蛹虫草的虫草素、K、Ca、Se、维生素等对人体有益的活性成分含量高于野生冬虫夏草[6-7]。

蛹虫草是一种极好地研究真菌退化机理的材料。如今，人工培育蛹虫草的技术相对成熟并且已经走入工厂进行产业化的生产，具有非常广阔的市场前景，但在生产实践中，蛹虫草的菌种极易发生退化，一般只能使用半年不到，有的只是传种几代就会产生严重的退化现象，表现出来的特征大多为不长或是只能长出非常少量的子实体，而且子实体的质量极差，给实现大规模的生产栽培带来了极大的风险[8]。因此，如何解决蛹虫草菌种容易退化的问题，是国内外学者研究的热点，而关于其退化的遗传机理方面的研究很少[9]。笔者从蛹虫草菌种的退化表现、早期的检测方法、菌种退化的影响因素和退化菌种的复壮等方面对蛹虫草菌种退化进行总结。

1 蛹虫草退化的表现

在人工栽培中，退化的表现有白脸现象、产生绒状菌丝、气生菌丝旺盛、吐黄水现象、子实体分叉或畸形（图1）。用显微镜对蛹虫草的菌丝进行观察，蛹虫草正常的菌丝较为粗壮挺立、分生孢子为念珠状，而退化的菌丝比较纤细弯曲，分生孢子为头状或山丘状[10]。退化菌种的子实体顶端及上部子囊壳有很多，正常菌种的子实体顶端及上部只有少量或没有子囊壳[11]。

2 早期检测方法

2.1 脱色能力测定

利用溴百里酚蓝（BTB）作为指示剂，通过比色的方法能较为简单地检测出金针菇的退化菌种，且其检测效果比较显著[12]。林清泉等[13]将该方法用于蛹虫草菌种的测定中，发现退化菌种与正常菌种经培养后显示不同的颜色，退化菌株对合成染料BTB的脱色能力明显低于正常菌株，在脱色率上也表现出差异，且菌液颜色、脱色率与pH密切相关，在pH调节能力方面正常菌株强于退化菌株，呈现出较浅的颜色和较高的脱色率，表明该方法可以作为快速鉴定蛹虫草退化菌株与正常菌株的检测手段。

2.2 脱氢酶活性测定

由于脱氢酶的活性可以显示出细胞活性的强弱，林清泉等[13]测定了不同蛹虫草菌种的脱氢酶活性，结果发现，正常状态下蛹虫草菌种的酶活性高于退化菌种的活性，且在所测定的蛹虫草菌种中，正常菌种能形成正常的蛹虫草子实体而退化菌种不能形成正常的子实体，这与脱氢酶活性的测定结果一致。黄春花等[14]对蛹虫草TTC-脱氢酶测定的条件进行了改良，使用培养6 d之后的蛹虫草菌液经4次生理盐水洗涤后，配制成0.15 g/mL的待用菌液；反应缓冲液是Tris-HCl，最适宜pH是8.4；最适反应温度是37 ℃、最适反应时间是3 h；酶促反应完成后及时把样品放置冰上，在4 ℃温度下离心后再用无菌水洗2次，用无水乙醇萃取后便可测定其吸光度，得到脱氢酶活性。因此，脱氢酶活性可以提早检测出退化的菌种，避免大规模培养过程中退化菌种的误用导致产生损失。

3 遗传背景因素

3.1 核相

有研究表明，蛹虫草核相发生了改变（异核体变成了同核体）会导致其菌种的退化，不能正常形成子实体[10，15]。正常的蛹虫草菌种是含有两类交配型基因的异核体，而退化的菌种是只含有其中一类交配型基因的同核体，只有当可亲和的初生同核菌丝体之间发生质配后，形成含有两类交配型基因的异核体，才能具备产生子实体的能力[10，15]。

3.2 基因突变

菌种的退化许多是由于基因突变引起的。使用PCR-RFLP与RAPD的方法，李美娜等[10，16]对野生蛹虫草及其退化菌种的基因进行了分析，结果显示，在5.8S+ITS区段，正常蛹虫草菌种和退化菌种最少有2个位点有差异，且退化菌种在第279和第360个碱基处发生了T到C的碱基点突变，所产生的这些突变很有可能与蛹虫草菌种退化的基因相关。

3.3 活性氧

蛹虫草菌种的退化也可能是受到活性氧与其引导的氧化应激的影响，活性氧是引起细胞凋亡的信使因子与效应因子，当蛹虫草机体处在氧化应激状态时，其细胞中的活性氧含量就会提高，蛹虫草机体就会处在易损状态，同时能使致病因素的毒性作用增强，可引起基因突变[17]。熊承慧等[18]克隆了来自构巢曲霉的谷胱甘肽过氧化物酶基因，通过真菌转化方法分别转化到已经退化菌种ZYF和能够正常结实的菌种CM01中进行过量表达，能够使已经退化的蛹虫草菌种恢复产生子实体的能力，而正常的蛹虫草菌种可以在继代培养过程中保持其性状的相对稳定，表明清除真菌细胞内的活性氧能够减缓其氧化胁迫水平，从而改善蛹虫草菌种退化的现象。

4 外界培养因素

4.1 蛹虫草菌种的保藏

在人工栽培的过程中，对蛹虫草菌种的保藏一般用低温试管菌种进行保藏，但通常半年后菌種就发生了退化，不产子实体或产生少量畸形子实体。有研究表明，保藏时间的长短与蛹虫草菌种的退化有一定的关系，保藏时间在30 d内的蛹虫草菌种的性状较为稳定，基本没有退化；保藏60 d后的菌种在栽培后，其性状表现出明显的差异，随着保藏时间的延长其退化的程度逐渐加剧[19]。蛹虫草菌种的保藏温度也会影响其退化的速度，温度高其退化的速度就快，反之，温度低蛹虫草菌种退化慢，其保藏的时间也可相应延长。采用4 ℃恒温保藏的时间没有进行温差保藏（白天10 ℃与晚上5 ℃）的时间长，有少量散射光的保藏条件比黑暗保藏条件更有利于蛹虫草菌种的保藏。

4.2 无性繁殖的转管次数

在大规模生产中，为了降低生产成本，最常用的做法就是采用转管传代的方法来生产蛹虫草虫草菌种，实际证明蛹虫草菌种转管传代超过3次以上，菌丝生长速度会下降，见光转色能力会变差，子实体的产量明显下降直至不产子实体[20]。因此，在生产和试验中必须注明菌种的繁殖代数，以免生产上出现不必要的损失[21]。

5 退化菌种的复壮

由于蛹虫草在人工栽培过程中使用的菌种很容易就退化了，故很难对已经退化的菌种进行直接复壮。西南林业大学生命科学学院实验室尝试了改善其营养方式的方法进行复壮，虽然适当含量的氮源和亚硒酸钠对蛹虫草子实体的产生有很好的促进作用，但并不能改善退化菌种的退化性状。因此，蛹虫草的复壮通常是可通过野外重新采集、生产选育来解决的[22]，其方法主要有组织分离法、孢子分离法、虫体回接法[8，23]。

6 展望

蛹虫草的人工栽培进入了产业化，市场对蛹虫草子实体的需求也极大地增加了，但生产中蛹虫草菌种退化极快，子实体质量不稳定；蛹虫草有很高的食药用价值，不少研究在筛选优良菌种，利用其菌丝生产其药性成分，但优良菌种极易退化。因此，有效地解决蛹虫草菌种的退化问题迫在眉睫。建立完善不易退化的蛹虫草菌种选育体系，有利于蛹虫草的生产实践。要从根本上解决退化问题，还是要研究蛹虫草的退化机理，可以结合其生长和代谢的相关基因进行研究，也可以对蛹虫草退化的代谢组和转录组进行研究。

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