连翘酯苷A对内毒素致鸡脾淋巴细胞白介素—17的影响

程广东 张强 岳丽红

摘要 [目的]研究内毒素和连翘酯苷A对鸡脾淋巴细胞中白介素-17（IL-17）水平的影响。[方法]将1日龄雏鸡正常饲养至50日龄时，心脏采血处死，表面消毒后，剖检用脾淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，将脾淋巴细胞分为20个组，具体为4个剂量组×5个时间点。4个剂量组分别为：对照组、LPS组（5 μg/mL）、连翘酯苷A预防低剂量组（200 μg/mL连翘酯苷 A+5 μg/mL LPS）、连翘酯苷A预防高剂量组（400 μg/mL连翘酯苷 A+5 μg/mL LPS）。5个时间点分别为0、6、12、24、48 h。通过采用ELISA和Real time-PCR方法检测脾脏淋巴细胞中IL-17水平。[结果]ELISA结果显示，与正常组相比，LPS组脾脏淋巴细胞中炎症因子IL-17含量升高；与LPS组比较，连翘酯苷A组脾脏淋巴细胞中上述炎症因子含量下降，表明脾脏中炎症因子的变化呈正相关性，通过抑制LPS诱导的鸡脾脏中上述炎症因子的升高，减轻炎症反应。Real time-PCR结果显示，与正常组相比，LPS组脾脏淋巴细胞中炎症因子IL-17 mRNA 表达量升高；与LPS组比较，连翘酯苷A组预防组脾脏淋巴细胞中上述炎症因子表达量下降，变化呈相关性，试验表明连翘酯苷A可以通过转录水平抑制LPS诱导的鸡脾脏淋巴细胞中上述炎症因子表达量的升高，减轻炎症反应。[结论]连翘酯苷A抑制鸡脾脏淋巴细胞中IL-17水平，可起到抗炎功能。

关键词 连翘酯苷A；内毒素；淋巴细胞；白介素-17

中图分类号 S853.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0106-03

Abstract [Objective] Effect of Forsythiaside A on IL17 level in spleen lymphocyte of chickens induced by lipopolysaccharide was studied.[Method]Dayold chickens were fed normally for 50 days， chickens were killed， collecting the spleen sterilely， by lymphotocyte separation medium， spleen lymphocytes were divided into 20 groups（4 doses×five time points）.Four groups included control group， LPS injection group（5 μg/mL），Forsythiaside A low dose treatment group （Forsythiaside A 200 μg/kg+LPS 5 μg/mL）， Forsythiaside A high dose treatment group （Forsythiaside A 400 μg/kg+LPS 5 μg/mL）.Five time points were：0 h，6 h，12 h，24 h，48 h.Lymphocyte IL17 level was determined by ELISA and Real timePCR. [Result]ELISA results showed that protein content of IL17 of spleen lymphocytes increased in LPS groups compared with control group. Forsythiaside A decreased content of above inflammation factor compared with LPS group.Decrease inflammation response showed positive correlation with inflammation factor change of spleen lymphocytes through inhibiting IL17 of spleen lymphocytes in the chicken by LPS to reduce inflammation reactions. Real timePCR results showed that IL17 mRNA expression level of inflammation factor of spleen lymphocytes increased in LPS groups compared with control group.While Forsythiaside A decreased mRNA expression of IL17.Decreasing inflammation response showed positive correlation with inflammation factor change of spleen lymphocytes through inhibiting inflammation factor of spleen in the chicken by LPS to reduce inflammation reactions.[Conclusion]Forsythiaside A perhaps decreased IL17 level，it had antioxidant and antiinflammatory function.

Key words Forsythiaside A；Lipopolysaccharide；Lymphocyte；IL17

連翘酯苷A具有镇痛、解热、抗氧化、抗病毒及抗菌等药理学活性，是连翘的主要有效成分之一，其可介导各种炎症因子，调控机体免疫应答。脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁的成分之一，可引起机体炎症反应，常被用于复制炎症模型[1]。IL-17等炎症因子往往作为免疫反应的重要指示物，IL-17是一种强力炎症细胞因子，IL-17包括IL-17A～F等6个家族成员，其主要是由Th17细胞（新近发现的CD4+ T细胞亚群）产生的[2-3]。IL-17F具有独特的生物学功能，可诱导多种趋化因子和细胞因子的表达，参与免疫细胞应答及炎症反应，在发挥抑制肿瘤细胞进展的同时，亦有促进肿瘤进展和转移的风险[4]。当炎症发生时，除了脾脏作为机体外周免疫器官，产生免疫应答外，IL-17与IL-17受体（IL-17 receptor，IL-17R）后引起生物学效应。IL-17募集、活化中性粒细胞，进而放大炎性效应，引起机体IL-6等细胞因子生成，加速炎症反应，在机体的肿瘤和免疫性疾病中等也起到重要作用[5]。故采用LPS诱导鸡脾淋巴细胞炎症模型，在连翘酯苷A作用下，从体外模型研究鸡脾淋巴细胞炎症因子的变化和相关性，探讨体外鸡脾淋巴细胞因子与炎症的关系，从调控炎症因子的角度，阐明连翘酯苷A抗LPS诱导的鸡脾炎症中的机制，为连翘酯苷A在鸡免疫调控中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1日龄AA肉鸡均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物中心。

主要试剂盒：连翘酯苷 A（纯度>98%）购于成都瑞芬思生物科技有限公司。内毒素LPS（血清型O55：B5，Sigma产品，批号L-2880）购自美国SIGMA 公司。

主要仪器：LightCycler480（FACS CantoⅡ，美国Roche公司），酶标仪型号（DENLEY DRAGON Wellscan MK3，Thermo，荷兰）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组与处理。

脾淋巴细胞的分离：将1日龄雏鸡正常饲养至50日龄时，心脏采血处死，表面消毒后，移至超净工作台中剖检，无菌取出脾脏，按程广东[6]的方法，用配好的淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用加10%胎牛血清的DMEM培养液稀释，将获得淋巴细胞进行计数，然后稀释到4×106个/mL，移到一次性培养瓶中，每瓶加入10 mL培养液。然后将连翘酯苷 A和LPS按如下4种剂量组分别加入到含淋巴细胞的DMEM培养液中，该试验将脾淋巴细胞共分为20个组，具体为4个剂量组×5个时间点。4个剂量组分别为：对照组、LPS组（5 μg/mL）、连翘酯苷A预防低剂量组（200 μg/mL连翘酯苷 A+5 μg/mL LPS）、连翘酯苷A预防高剂量组（400 μg/mL连翘酯苷 A+5 μg/mL LPS）。5个时间点分别为0、6、12、24、48 h。

1.2.2 ELISA检测鸡脾淋巴细胞中IL-17蛋白含量。

收集不同处理组脾淋巴细胞后，按程广东[6]的方法检测各组血清样品IL-17含量。

1.2.3 qRT-PCR检测鸡脾淋巴细胞中IL-17 mRNA表达量。

收集各不同处理组脾淋巴细胞后，直接加入TRIZOL试剂0.9 mL，提取RNA，按程广东[6]的方法，将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用于检测脾脏IL-17的CP值，经内参 β-actin校正，以归一法比较各组鸡血液中IL-17的mRNA表达量。

其中提取RNA所用物品均应严格按消除RNase的常规方法处理。

1.3 数据处理与统计

试验数据通过SPSS 18.0软件进行统计分析，以（±s）表示数据，采用P检验进行试验统计，*P<0.05和**P<0.01表示与对照组比较，#P<0.05和##P<0.01表示与LPS组比较。

2 結果与分析

2.1 脾淋巴细胞中IL-17蛋白含量

由图1可以看出，同一时间不同处理组进行比较，与正常对照组比较，LPS组中鸡脾淋巴细胞不同时间点中IL-17蛋白含量明显升高，差异极显著（P<0.01）；与LPS组比较，不同剂量组的（200 μg/mL和400 μg/mL）连翘酯苷 A抑制LPS诱导的IL-17的蛋白含量升高，差异均极显著（P<0.01），并成剂量依赖性。随着连翘酯苷 A与LPS作用鸡脾淋巴细胞作用时间延长，LPS作用时间组整体IL-17蛋白含量升高，且在作用6 h时IL-17蛋白含量达到最高值；连翘酯苷A预防低剂量组与连翘酯苷A预防高剂量组IL-17蛋白在0、6、12 h含量升高，且随着作用时间延长，IL-17蛋白含量呈线性上升，且在12 h组IL-17蛋白含量达到最高值，在24、48 h，随着作用时间延长，IL-17蛋白含量下降。

2.2 脾淋巴细胞中IL-17 mRNA表达量

由图2可以看出，同一时间点不同处理组进行比较，与正常组相比，LPS可显著提高鸡脾淋巴细胞不同时间点中IL-17 mRNA含量，差异均极显著（P<0.01）；连翘酯苷 A预防组抑制LPS引发的鸡脾淋巴细胞不同时间点中IL-17 mRNA含量上升，差异均极显著（P<0.01），并成剂量依赖性。随着连翘酯苷 A与LPS作用鸡脾淋巴细胞作用时间延长，LPS作用时间12 h组IL-17 mRNA含量达到最高值；连翘酯苷A预防低剂量组与连翘酯苷A预防高剂量组IL-17 mRNA在12 h组达到最高值。表明连翘酯苷 A与LPS可以通过影响IL-17 mRNA含量影响炎症反应。

3 结论与讨论

3.1 LPS致脾淋巴细胞炎症机制

吴景华等[7]研究表明，青蒿素作用后肝癌组织中Caspase 3的表达较阴性对照组增加，较阳性对照组表达有所减少，但IL-17R的表达较阴性对照组及阳性对照组降低；青蒿素组荷瘤鼠血清IL-17的浓度明显下降。阮洪生等[8]研究表明，LPS能明显诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分泌炎症因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6，而表儿茶素可以明显降低LPS诱导的RAW 264.7细胞释放炎症因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6。葛建彬等[9]研究表明，小鼠缺血再灌后缺血侧大脑皮层p65蛋白水平明显增高，枸杞多糖能显著降低p65蛋白水平，能显著降低缺血再灌后TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白生成。王玉明等[10]研究表明，与LPS组相比，芹菜素治疗组可以显著升高肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平，而芹菜素可以显著降低肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平，并抑制NF-κB信号通路的激活，芹菜素可以通过抑制NF-κB的激活并降低炎性细胞因子的水平，从而对小鼠急性肺损伤产生抗炎保护作用。脾脏是鸡体外周免疫器官，其对细胞免疫和体液免疫起着重要作用，在机体的免疫系统中起重要作用。而脾淋巴细胞是脾脏发挥免疫反应的直接效应细胞。体外试验观察和分析LPS和连翘酯苷A对体外分离培养的鸡脾淋巴细胞的炎症因子水平，可更直观地分析和比较效应细胞的直接抗炎作用。该试验研究LPS和连翘酯苷A作用于鸡脾淋巴细胞后，鸡脾淋巴细胞中炎症因子mRNA表达量与蛋白含量上升，但也存在时间和剂量效应，鸡脾脏和0、6、12、24和48 h组脾淋巴细胞IL-17的mRNA表达量升高，表明LPS 能引发机体炎症，导致机体IL-17等炎症因子上升，加剧炎症反应。