米饭中蜡样芽孢杆菌生长模型建立的研究

黄丹阳+曹慧+徐斐+袁敏+宇盛好+彭少杰

摘要：本研究首先考察了温度（10、15、20、25、30、34、37和43 ℃）对米饭中蜡样芽孢杆菌生长的影响，并采用SGompertz和SLogistic模型对不同温度下蜡样芽孢杆菌的生长数据进行拟合；在此基础上，以拟合度（R2）、准确因子（Af）和偏差因子（Bf）为指标，比较并建立了米饭中蜡样芽孢杆菌的二级生长模型。结果表明，SGompertz模型能更好的拟合米饭中蜡样芽孢杆菌在不同温度下的生长数据，因此选择其作为蜡样芽孢杆菌在米饭中的一级生长模型。采用平方根模型建立的米饭中蜡样芽孢杆菌二级生长模型的Af值分别为1.12和1.14，Bf值分别为0.99和1.03，拟合度分别为0.9537和0.8503；采用二次多项式模型建立的二级生长模型的Af值分别为1.24和1.11，Bf值分别为0.92和0.92，拟合度分别为0.9550和0.9462，可见二次多项式模型能够较准确地预测米饭中蜡样芽孢杆菌的生长状况，模型具有可靠性。

关键词：蜡样芽胞杆菌；米饭；一级生长模型；二级生长模型

Study on predictive models for the growth of Bacillus cereus in cooked rice

HUANG Dan-yang1， CAO Hui1， XU Fei1*， YUAN Min1， YU Sheng-hao2， PENG Shao-jie2*

（1.School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China；2.Shanghai Center for Adverse Drug and Medical Device Reaction Monitoring Shanghai 200233， China）

Abstract： The paper is designed to study the effects of temperature （10， 15， 20， 25， 30， 34， 37 and 43 ℃） on the growth of Bacillus cereus in rice.And then the SGompertz and SLogistic models were selected as the primary growth models to fit the growth curve of Bacillus cereus in cooked rice with variable storage temperatures.Using the fitness （R2）， accuracy factor （Af） and deviation factor （Bf） as evaluation index， quadratic polynomial model and square root model were selected further to fit the secondary growth models of Bacillus cereus in cooked rice.The results showed that the SGompertz model could well describe the growth of Bacillus cereus at different temperature， and therefore it was chosen as the primary growth model of Bacillus cereus in rice.For the developed square root model， Af was 1.12 and 1.24， Bf was 0.99 and 1.03， R2 values were 0.9537 and 0.8503； respectively. For the developed quadratic polynomial model， Af was 1.24 and 1.11， Bf was 0.92 and 0.92， R2 values were 0.9550 and 0.9462； respectively. The results show that the quadratic polynomial model can well predict the growth of Bacillus cereus in rice.

Keywords：Bacillus cereus； cooked rice； primary growth model； secondary growth model

中圖分类号：文献标志码：文章编号：

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）在自然界中普遍存在，其最适生长温度为25℃～37℃，最适生长pH值范围为4.3～9.3[1]。蜡样芽孢杆菌可引起呕吐型和腹泻型食物中毒。呕吐型食物中毒主要由低分子量的呕吐毒素（Cereulide）引起[2]，该毒素常在米饭类食品中被检出，耐热，耐蛋白酶水解酶，对酸碱稳定，高温121℃处理30 min 仍不失活[3-4]。腹泻型食物中毒主要由腹泻毒素引起，能导致腹泻型胃肠炎。蜡样芽孢杆菌主要以孢子状态广泛存在于自然界和食品中，尤其是谷物等淀粉含量高的食品[5]。吕荣[6]统计分析了近10年来（1993～2002年）国内报道的47起蜡样芽孢杆菌食物中毒事件，发现被污染的食品主要为剩米饭（44.6%）和开水泡饭（17.0%）。中国CDC《食源性疾病监测工作手册》将米饭和米粉中的蜡样芽孢杆菌作为重点监测项目。近年来，由蜡样芽孢杆菌导致的食物中毒事件呈增加的趋势[7]。米饭作为我国居民的主食是蜡样芽孢杆菌的重要污染源，然而对米饭中蜡样芽孢杆菌生长预测模型的研究较少。因而，本研究首先考察了温度（10、15、20、25、30、34、37和43 ℃）对米饭中蜡样芽孢杆菌生长的影响，并采用SGompertz和SLogistic模型对不同温度下蜡样芽孢杆菌的生长数据进行拟合；在此基础上，以拟合度、准确因子和偏差因子为指标，比较并建立了米饭中蜡样芽孢杆菌的二级生长模型，研究结果可为米饭中蜡样芽孢杆菌的安全控制提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器设备

米饭，取自集体食堂；蜡样芽胞杆菌菌株（CMCC（B）66301），购于上海复祥生物科技有限公司；甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础（MYP）、多粘菌素B、50%卵黄乳液、脑心浸出液肉汤（BHI）、无菌均质袋购于青岛高科园海博生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

SW-CJ-1FD型洁净工作台，购自于苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HWS-150型恒温恒湿培养箱，购自于上海比朗仪器有限公司；SCIENTZ-09无菌均质器，购自于宁波新芝生物科技股份有限公司；YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅，购自于上海博迅实业有限公司。

1.3试验方法

1.3.1蜡样芽孢杆菌的接种、培养及计数

将蜡样芽孢杆菌接种到BHI营养液中进行培养，每隔一段时间取出在600 nm下测吸光值，同时用平板计数法计数，建立吸光度与细菌数量之间的线性关系。将米饭按无菌操作装入无菌均质袋，每袋约为10g；用移液枪吸取1 mL稀释后的菌悬液均匀滴至米饭表面，控制初始接种量为103 CFU/g；将接种后的米饭分别置于不同温度（10、15、20、25、30、34、37和43 ℃）下进行培养[8]；根据不同温度下蜡样芽胞杆菌的生长速率，每隔一段时间取样，并按照GB 4789.14-2014《食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》中的平板计数法测定样品中的菌落数。

1.3.2 米饭中蜡样芽孢杆菌一级生长模型的建立

采用SGompertz模型[9]（式1）和SLogistic模型[9]（式2）对不同温度下米饭中蜡样芽胞杆菌的生长数据进行拟合，并分别计算出相应的最大比生长速率（μmax）和迟滞期（λ）。

lg（Nt/N0）=a×exp{-exp[-k×（t-xc）]}（1）

lg（Nt/N0）=a×{1+exp[-k×（t-xc）}（2）

式中：Nt 、N0分别表示在时间t时和初始时间的微生物的数量（cfu/g）； a为最大菌数Nmax与初始菌数N0的差值；xc为达到相对最大生长速率所需的時间；k为在时间xc的相对生长速率。

1.3.3 米饭中蜡样芽孢杆菌二级生长模型的建立

平方根模型[10] （式3、4）和二次多项式模型[11] （式5）常用来描述温度对微生物生长的影响。因而，本研究基于一级生长模型中所获得的米饭中蜡样芽孢杆菌的μmax和λ值，选用这两种模型对米饭中蜡样芽孢杆菌的二级生长模型进行拟合。

1.3.4 模型的验证

采用Bf （式6）和Af （式7）对所建立的二级模型进行验证。Bf和Af被认为是验证模型可靠度的有效工具[12-13]。

2 结果与分析

2.1 米饭中蜡样芽孢杆菌的一级生长模型

本研究首先考察了温度（10、15、20、25、30、34、37和43 ℃）对米饭中蜡样芽孢杆菌生长的影响，并采用SGompertz和SLogistic模型对不同温度下蜡样芽孢杆菌的生长数据进行拟合。由两种模型拟合的米饭中蜡样芽孢杆菌的生长曲线如图1-8所示，相应的拟合参数如表1所示。结果表明，由SGompertz和SLogistic模型拟合的米饭中蜡样芽孢杆菌在不同温度下的一级生长模型的R2值并无显著性差异（P>0.05）。SGompertz方程是一种双指数函数，常用于拟合微生物的生长，且其对米饭中蜡样芽孢杆菌生长的拟合值均略高于SLogistic模型，因而选择其作为不同温度下米饭中蜡样芽孢杆菌的一级生长模型。

根据SGompertz模型拟合的米饭中蜡样芽胞杆菌在不同温度的最适生长模型见表2，由此计算的μmax和λ见表3。从结果可以看出，随着温度的增加，米饭中蜡样芽胞杆菌的最大比生长速率呈上升的趋势，反之迟滞期呈下降的趋势。

2.2米饭中蜡样芽胞杆菌的二级生长模型

根据SGompertz模型计算得到的米饭中蜡样芽胞杆菌在不同温度下的μmax和λ，采用平方根模型和二次多项式模型分别拟合了蜡样芽胞杆菌在米饭中的二级生长模型，结果如图9和图10所示。

由图9可见，采用平方根模型（图9a）拟合的蜡样芽孢杆菌生长温度与其μmax关系的R2为0.9537，采用二次多项式模型（图9b）拟合的R2为0.9550，两者的拟合结果非常接近。由图10可见，采用二次多项式模型（图10a）拟合的蜡样芽孢杆菌生长温度与其λ关系的R2为0.8503，二次多项式模型（图10b）拟合的R2为0.9462。由此可见，二次多项式模型的拟合结果优于平方根模型的拟合结果，因此二次多项式模型可以较好的预测蜡样芽孢杆菌生长温度与λ和μmax的关系。

2.3模型验证

Bf和Af是非常有价值的模型验证工具，因而本研究采用Bf和Af对所建立的平方根模型和二次多项式模型进行验证，结果如表4所示。

由表4可见，在对温度与μmax和λ之间的关系进行拟合时，采用平方根模型建立的米饭中蜡样芽孢杆菌二级生长模型的Af值分别为1.12和1.14，Bf值分别为0.99和1.03，拟合度分别为0.9537和0.8503；采用二次多项式模型建立的米饭中蜡样芽孢杆菌二级生长模型的Af值分别为1.24和1.11，Bf值分别为0.92和0.92，拟合度分别为0.9550和0.9462。Ross等研究表明[14-15]，Af和Bf值越接近于1，所建模型的可信度越高，如果Bf值在0. 70～0. 90或1. 06～1. 15之内，Af值在1.0-1.9之内所建的模型均可被接受[16]。综合所建二级模型的R2、Bf及Af值，本研究选择二次多项式模型作为米饭中蜡样芽孢杆菌的二级生长模型。

3结论

本文研究了10、15、20、25、30、34、37和43 ℃条件下米饭中蜡样芽孢杆菌的生长规律，建立了米饭中蜡样芽孢杆菌的一级生长模型和二级生长模型。对于一级生长模型，采用SLogistic模型和SGompertz模型对蜡样芽孢杆菌的生长数据进行拟合。此两种模型为预测微生物学中最常见且使用最普遍的两种模型。在建模后，通过对两种模型拟合度等相关因子进行对比，得到拟合度较高的模型（SGompertz模型）作为本文的一级生长预测模型。SGompertz方程是一种双指数函数，常用于拟合微生物的生长，且其对米饭中蜡样芽孢杆菌生长的拟合值均略高于SLogistic模型，因而选择其作为不同温度下米饭中蜡样芽孢杆菌的一级生长模型，表明实验所得数据与实际生长情况更为符合，模型更为可靠。通过R2、Bf及Af的比较，二次多项式模型作为二级生长模型能够更准确、更可靠地预测米饭中蜡样芽孢杆菌的生长状况。

蜡样芽孢杆菌分布广泛，常见于土壤、灰尘和污水中，在许多植物性食品和生熟食品中也十分常见，因此很容易引起食物中毒。由一级模型和二级模型的拟合结果可知，NaCl浓度对蜡样芽孢杆菌的生长有影响。除蒸煮米饭外，若有需要添加NaCl作为添加剂调节食物风味的产品，则需合理控制食品中NaCl的添加量，以便控制蜡样芽孢杆菌的生长。

此外，米饭蒸煮时，应尽量控制操作过程中的环境温度。刚蒸煮出来的米饭温度一般较高在50℃以上，此时一般没有蜡样芽孢杆菌的存在。但在之后的储存过程中，环境温度逐渐降低，若处理措施不当或卫生控制不严格等，则很容易滋生微生物。并且如果保存时间较长环境温度较高，则蜡样芽孢杆菌的芽孢有可能萌发，所以应尽量缩短米饭蒸煮后的保存时间，并且尽量降低储藏的环境温度。

本试验结果可作为米饭中蜡样芽孢杆菌定量风险评估的参考，并为制定米饭中蜡样芽孢杆菌限量标准和风险管理措施等提供科学依据。

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