高效液相色谱法同时测定外用伤筋药水中栀子苷和芍药苷含量

许雪峰，杜远东 ，任杰，杨滢，黄东萍

（陕西省汉中市食品药品检验检测中心，陕西汉中723000）

·检验检测·

高效液相色谱法同时测定外用伤筋药水中栀子苷和芍药苷含量

许雪峰，杜远东 ，任杰，杨滢，黄东萍

（陕西省汉中市食品药品检验检测中心，陕西汉中723000）

目的建立同时测定外用伤筋药水中栀子苷和芍药苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法色谱柱为Kromasil 100－5－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流动相为乙腈－0.1%磷酸溶液（14∶86），流速为1.0 m L／min，检测波长为235 nm，柱温为25℃，进样量为10 L。结果栀子苷和芍药苷的检测质量浓度线性范围分别为2.07～51.80 g／mL(r＝0.999 9)和2.08～51.88 g／mL(r＝0.999 9)；定量限分别为10.35 ng和20.80 ng,检测限分别为3.10 ng和6.24 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；平均加样回收率分别为99.95%(n＝6)和99.56%(n＝6)；RSD分别为1.15%和0.44%(n＝6)。结论该方法操作简便、准确、专属性强、重复性好，可用于测定外用伤筋药水中栀子苷和芍药苷的含量。

高效液相色谱法；外用伤筋药水；栀子苷；芍药苷；含量测定

外用伤筋药水为陕西汉中勉县骨伤科医院研制的院内制剂，由制川乌、制草乌、羌活、栀子、赤芍、木瓜、半夏等15味中药组方，具有活血、通络、止痛的功效，主要用于治疗各种跌打损伤引起的经络挛缩、筋骨酸痛、风湿麻木及软组织损伤。方中重用栀子和赤芍，其中栀子有凉血解毒功效，可外用消肿止痛[1]；赤芍能清热凉血、散瘀止痛，多用于跌打损伤[2]。栀子苷和芍药苷分别为栀子和赤芍中含量较高且与功效有关的化学成分，均具有抗炎镇痛的药理作用[3－4]。外用伤筋药水为传统外用搽剂，现行质量标准过于落后，仅有鉴别项和检查项，未确定主要功效成分含量测定指标，难以保证制剂质量的均一、稳定。本研究中参照复方制剂一测多评的研究思路[5]，采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定其主要功效成分栀子苷和芍药苷的含量，旨在为综合控制外用伤筋药水的质量提供简便、快捷的分析方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－20AD型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Kromasil 100－5－C18色谱柱（瑞典Akzo Nobel公司）；BT 25S型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；Nexpower 1000型纯化水仪（韩国Human公司）；Transferpette可调移液器（德国Brand公司）；KQ－250DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

外用伤筋药水（陕西汉中勉县骨伤科医院自制，批号分别为20160401，20160502，20160801，规格为每瓶100mL）；栀子苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110749－200714）；芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110736－201438，纯度为96.4%）；甲醇为色谱纯（赛默飞世尔科技有限公司）；磷酸为分析纯（成都科龙化工试剂厂）；水为实验室自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil100－5－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈－0.1%磷酸溶液（14∶86）；流速：1.0 m L／min；检测波长：235 nm；柱温：25℃；进样量：10μL。

2.2 溶液制备

对照品贮备液：取栀子苷和芍药苷对照品适量，精密称定，分别置2个100mL容量瓶中，加甲醇适量，超声至其充分溶解，放冷，再加甲醇至刻度，摇匀，作为栀子苷对照品贮备液（质量浓度为103.60μg／mL）和芍药苷对照品贮备液（质量浓度为103.75μg／m L）。

混合对照品溶液：分别精密量取栀子苷对照品贮备液和芍药苷对照品贮备液各2.0 m L，置10 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得栀子苷和芍药苷质量浓度分别为20.72，20.75μg／mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：精密量取外用伤筋药水样品2.0mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按外用伤筋药水的处方比例，以辅料代替栀子和赤芍，根据其生产工艺流程制备不含栀子和赤芍的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验：分别取上述混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见图1。可见，在该色谱条件下，供试品溶液与对照品溶液中栀子苷和芍药苷色谱峰保留时间一致，栀子苷和芍药苷均能与相邻色谱峰达到基线分离，理论板数均大于10 000，分离度、拖尾因子均符合相关技术要求[6]。阴性对照品溶液在栀子苷和芍药苷出峰时间处无吸收峰。提示其他成分对测定无干扰，该测定方法专属性好。

线性关系考察：分别精密量取2.2项下栀子苷和芍药苷对照品贮备液各1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 m L，分别置50m L容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得栀子苷质量浓度分别为2.07，4.14，10.36，20.72，51.80μg／mL，芍药苷质量浓度分别为2.08，4.15，10.38，20.75，51.88μg／mL的系列标准曲线溶液。按拟订色谱条件进样测定，计算峰面积积分值。分别以栀子苷和芍药苷质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，栀子苷为Y＝14 532.30X＋690.38，r＝0.999 9（n＝5）；芍药苷为Y＝14 891.70X－1 120.35，r＝0.999 9（n＝5）。结果表明，栀子苷和芍药苷质量浓度分别在2.07～51.80， 2.08～51.88μg／mL范围内与峰面积积分值线性关系良好。

1.栀子苷2.芍药苷A.混合对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图1高效液相色谱图

定量限与检测限考察：分别取2.2项下栀子苷和芍药苷对照品贮备液适量，逐步稀释，按拟订色谱条件进样测定。当信噪比为10∶1时，得栀子苷和芍药苷的定量限分别为10.35，20.80 ng；当信噪比为3∶1时，得栀子苷和芍药苷的检测限分别为3.10，6.24 ng。

精密度试验：取2.2项下混合对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，连续进样6次，记录峰面积。结果栀子苷和芍药苷峰面积的RSD分别为0.67%，0.58%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下同一供试品（批号为20150112）溶液，置室温下，分别于0，2，4，6，8，12 h时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果栀子苷和芍药苷峰面积的RSD分别为0.81%，0.94%（n＝6），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

重复性试验：取外用伤筋药水1瓶（批号为20150112），依法制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录栀子苷和芍药苷峰面积。结果栀子苷和芍药苷峰面积的RSD分别为0.85%，1.08%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的外用伤筋药水样品（批号为20160401）适量，置25m L容量瓶中，分别加入样品含量为50%，100%，150%的栀子苷和芍药苷对照品，按供试品溶液制备方法制备6份待测溶液。按抉订色谱条件进样测定，记录溶液中栀子苷和芍药苷峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取3批外用伤筋药水，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积值，并用栀子苷和芍药苷回归方程分别计算其含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（ g／m L，n＝3）

3 讨论

3.1 测定指标选择

中药复方制剂的组方是在中医药理论指导下形成的，所含成分复杂，其临床疗效为多种成分综合作用的结果，任意成分含量发生变化都会影响药效。中药复方制剂的质量评价长期以来多以单一指标成分进行控制，而中药多成分的复杂性决定了单一成分指标评价难以表达中药的质量，难以真正体现中药的多效性和整体性[7]。中药多靶点的作用特点要求对其进行多成分质量控制，应选择多个有效成分或主要成分作为复方制剂的定量指标，才能更真实地反映中药的内在质量，特别是对与功效相关的化学成分[8]。

栀子苷和芍药苷为外用伤筋药水主要化学成分，现代研究显示，其药理作用与外用伤筋药水的功效基本一致。根据含量测定项选定原则[9]，本试验中选取栀子苷和芍药苷2个化合物作为指标成分，能在一定程度上反映出制剂的整体质量，较测定单一指标成分更科学，弥补了其质量标准中无含量测定项的不足。

3.2 色谱条件选择

试验过程中分别对甲醇－水[10]、甲醇－0.1%磷酸溶液[11]、乙腈－水[12]及乙腈－0.1%磷酸溶液[13]等不同流动相系统进行了考察，最终发现，以乙腈－0.1%磷酸溶液（14∶86）为流动相，能使其各组分较好地分离，其中磷酸可作为解离抑制剂，抑制组分解离，增强保留。栀子苷和芍药苷分别属环烯醚萜苷和双环单萜苷化合物，化学性质相近，二者紫外最大吸收峰波长也较接近，研究显示，选取235 nm作为检测波长时得到的色谱峰峰形和响应值均较理想。

3.3 含量限度制订

2015年版《中国药典（一部）》规定，栀子药材中栀子苷含量不得少于1.8%[2]248，赤芍药材中芍药苷含量不得少于1.8%[2]158。外用伤筋药水中栀子和赤芍均为药材原粉入药，栀子和赤芍投料量分别为1 200，600 g，浸提精制后灌装成每瓶100 m L，共制得1 000瓶。按有效成分转移率90%计[14]，根据投料量及理论含量计算，外用伤筋药水中含栀子苷应不少于194.4μg／mL，含芍药苷应不少于97.2μg／mL。

本试验中首次同时测定了外用伤筋药水中栀子苷和芍药苷的含量，方法可操作性强，结果准确可靠，可应用于外用伤筋药水的质量控制。外用伤筋药水处方包含中药较多，成分复杂，受对照品和试验条件限制，本试验中选取2种化学成分作为含量测定指标，略显不足，但填补了含量测定项的空白，后续试验中可探索不同方法同时测定更多化学成分，从多方面控制其质量，以确保其临床药效稳定发挥。

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Content Determ ination of Geniposide and Paeoniflorin in Shangjin Lotion by HPLC

Xu Xuefeng，Du Yuandong，Ren Jie，Yang Ying，Huang Dongping
（Hanzhong Center for Food and Drug Control，Hanzhong，Shaanxi，China 723000）

Objective To establish an HPLC method for content determination of geniposide and paeoniflorin in Shangjin Lotion.M ethods The HPLC method was adopted on the column of Kromasil 100－5－C18colomn（250 mm×4.6 mm，5μm）with mobile phase of acetonitrile－0.1%phosphoric（14∶86）at a flow rate of 1.0 m L／min，the detection wavelength was 235 nm，the column temperature was 25℃，the injection volume was 10μL.Resu lts The linear range was 2.07－51.80μg／m L for geniposide（r＝0.999 9）and 2.08－51.88μg／mL for paeoniflorin（r＝0.999 9）；limits of quantification were 10.35 ng，20.80 ng，limits of detection were 3.10 ng，6.24 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%.The average recoveries were 99.95%（RSD＝1.15%，n＝6）and 99.56%（RSD＝0.44%，n＝6）.Conclusion The method is easy to operate，accurate，specific and reproducible for the content determination of geniposide and paeoniflorin in Shangjin Lotion.

HPLC；Shangjin Lotion；geniposide；paeoniflorin；content determination

R284.1

A

1006－4931(2017)10－0035－04

2017－01－06；

2017－02－23)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.009

许雪峰，男，主管药师，研究方向为药物分析，（电子信箱）792623448＠qq.com。

杜远东，男，硕士研究生，药师，研究方向为药物分析，（电子信箱）409449431＠qq.com。