鸡MHCⅠ分子单链三聚体真核表达载体的构建和表达

戴银 单文杰 胡晓苗 赵瑞宏 侯宏艳　沈学怀　潘孝成　周学利 张丹俊

摘要 [目的]探索主要组织相容性复合体 Ⅰ 类分子（Major Histocompatibility Complex，MHC Ⅰ）提高抗原呈递效率的方法，获得具有免疫学活性的抗原肽-MHC Ⅰ 分子单链三聚体。[方法]采用基因重组技术，通过连接肽（G4S）3将鸡新城疫病毒抗原表位短肽HN（aa346-353）与鸡MHC Ⅰ（B-F）分子二聚体的编码基因共价串联，构建带有绿色荧光标签蛋白的真核表达载体pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α。[结果]转染真核细胞293T后，荧光显微镜观察可见，重组融合蛋白HN346-353-B-Fβ2m-α分子三聚体主要表达定位于真核细胞的内膜系统。Western Blot结果表明，在预期蛋白分子量大小位置有明显的特异反应带，重组蛋白与其相应抗体可发生特异性结合反应。[结论]重组质粒能够在真核细胞中表达，且融合蛋白具有良好的生物学活性。

关键词 鸡MHC B-F分子；单链三聚体；真核表达

中图分类号 S188+.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）01-0139-04

Construction and Expression of Single Chain Trimer of Chicken MHCⅠMolecular

DAI Yin1， SHAN Wenjie2， HU Xiaomiao1， ZHANG Danjun1* et al

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Anhui Academy of Agricultural Science， Hefei， Anhui 230031；2.College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract [Objective] To improve the efficiency of antigen presentation of MHCⅠmolecule， the single chain trimer of pepideMHCⅠmolecules were obtained. [Method]The chicken MHCⅠ（BF） gene and the epitope protein HN （aa346353） of Newcastle disease virus were linked by a linker with sequences encoding（G4S）3. Then the recombinant plasmids （pEGFPHN346-353BF β2mα） with green fluorescent protein was constructed. Further the recombinant plasmid was transfected into eukaryotic cell 293T. [Result]The gene product of recombinant plasmid was mainly located to endomembrane system of the cells by fluorescence microscopy. Moreover， the positive reactions were observed by the method of Western Blot， in accordance with the target proteins， and the proteins had the binding reaction with specific antibodies. [Conclusion]The recombinant plasmid was expressed in eukaryotic cells with a good biological activity.

Key words Chicken MHC BF molecule；Single chain trimer；Eukaryotic expression

雞主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）分子又被命名为B复合体，位于16号染色体上，包括B-F、B-L和B-G 3个基因座。其中B-F、B-L所编码的抗原在结构和功能上分别类似于哺乳动物MHC的 Ⅰ 类和 Ⅱ 类抗原[1-2]。鸡MHC分子与多种传染性疾病的遗传抗性密切相关[3]。研究发现，B2和B21单倍型鸡对马立克氏病具有不同程度的抗性，而B19高度易感[4-7]；此外，B15和B4单倍型鸡对劳氏肉瘤病病毒较易感，而B12单倍型鸡能够产生明显的抗肿瘤反应[8]。同时国外一些公司已经由此培育出了相关的抗病遗传品系。

与人类MHC Ⅰ 分子相似，B-F分子是一种膜结合糖蛋白，由α链和β2m微球蛋白组成，两者呈非共价键结合，主要负责内源性抗原肽的呈递。研究表明，利用基因工程技术将抗原短肽以及MHC Ⅰ 类分子的α和β2m链，用连接肽串联为融合基因，表达的蛋白能以更稳定的单链三聚体（Single Chain Trimer，SCT）在细胞表面表达，且能更有效地激活CD8 + T细胞免疫应答[9-11]。该结构在提高内源性抗原肽呈递效率的研究方面具有重要意义，同时也为MHC Ⅰ 类分子呈递外源性抗原肽提供了一条新思路。笔者前期已经构建了具有免疫学活性鸡MHC Ⅰ 类（B-F）分子的α和β2m链的二聚体结构，将构建抗原短肽与MHC Ⅰ 类分子的单链三聚体结构，以期为构建以MHC Ⅰ 分子为基础的高效DNA疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 工具酶、质粒、菌株和细胞及主要试剂

T4 DNA连接酶、Premix Ex Taq DNA聚合酶、Hind Ⅲ、Sal Ⅰ 和Nhe Ⅰ 均购自宝生物工程（大连）有限公司；脂质体转染试剂盒 XfectTM购自 Clontech 公司；胎牛血清、DMEM培养基购自 GIBCO 公司；标签蛋白GFP单克隆抗体、超纯质粒抽提试剂盒、细胞裂解液、膜显色液等购自碧云天生物技术有限公司。鸡MHC B-Fα蛋白的鼠源多抗血清、重组质粒pMD18-T-B-F-HN346-353、pMD18-T-B-Fβ2m-α、绿色荧光载体pEGFP-N1、Rosetta（DE3）菌株、293T细胞均由安徽省农业科学院兽医实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计。参照GenBank数据库中已发表的鸡MHC B-Fα和β2m链cDNA序列（GenBank登陆号为GU451331和M84767），以及编码连接肽（G4S）3的基因序列和真核表达载体pEGFP-N1序列，用Primer Premier 5.0软件设计2条特异性引物。基因片段Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3的扩增引物，P-HN346-353-F：5′-CTAGCTAGCGGAGCCATGGGGAAGGC-3′，P-HN345-353-R：5′-CCCAAGCTTTGATCCGCCTCCACCTGA-3′；雞MHC B-Fβ2m-α二聚体的两端扩增引物，pEGFP-β-F：5′-CCCAAGCTTCAGGCCGACCTGACGC-3′，pEGFP-α-R：5′-ATGTCGACATGGAGGGGTTGCTCCCGGGCGCG-3′。

基因片段Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3长度为150 bp，依次包括编码B-F分子β2m链的信号肽序列、新城疫病毒HN蛋白抗原短肽HN346-353（DEQDYQIR）和连接肽（G4S）3的基因序列，两端引入Nhe Ⅰ 和Hind Ⅲ 的酶切位点。B-Fβ2m-α二聚体的扩增长度为1 334 bp，依次包括编码B-F分子β2m链成熟肽，连接肽（G4S）3和B-F分子α链成熟肽的基因序列，两端引入Hind Ⅲ 和Sal Ⅰ 的酶切位点。

1.2.2 基因的扩增。分别以重组质粒pMD18-T-B-F-HN346-353和pMD18-T-B-Fβ2m-α为模板，扩增Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3和 B-Fβ2m-α基因序列。反应体系为Premix Ex Taq 20.0 μL，上下游引物各1.0 μL，质粒DNA 1.0 μL，加双蒸水补足50.0 μL。扩增程序为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，33 个循环，72 ℃延伸10 min；95 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环，72 ℃延伸10 min。

1.2.3

pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α重组质粒的构建与鉴定。首先将B-Fβ2m-α的扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，用DNA凝胶回收试剂盒回收，然后连入pEGFP-N1载体，构建重组质粒pEGFP-B-Fβ2m-α。16 ℃水浴过夜，转化大肠杆菌Rosetta感受态，涂布于含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，37 ℃温箱培养过夜，PCR初步筛选阳性克隆后，用小量碱法提取质粒。随后，将Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3基因 PCR产物纯化后，连入重组载体pEGFP-B-Fβ2m-α，转化感受态大肠杆菌，PCR初步筛选阳性克隆后，提取质粒。分别用Nhe Ⅰ 和Hind Ⅲ，Nhe Ⅰ 和Sal Ⅰ 双酶切重组质粒，阳性重组质粒进行测序，测序结果与已报道的相应基因序列比对。

1.2.4 超纯质粒的提取及瞬时转染。超纯质粒DNA的提取方法，按照超纯质粒纯化试剂盒说明书进行。转染前1 d，取无菌爬片于6孔培养板中，以每孔293T细胞量为0.5×105～2.0×105个进行铺板；转染时每孔准备1.5 mL离心管2个；将5 μg的空载体质粒和重组质粒分别溶于一管100 μL染试剂Xfect Buffer，轻轻混匀；同时分别将1.5 μL Xfect polymer溶于一管98.5 μL Buffer中；然后充分混合以上2管溶液，孵育10 min；将200 μL转染混合物置入每孔细胞培养基中，使充分混匀；细胞板置5%CO2、37 ℃培养。24 h后，进行表达蛋白的检测分析。

1.2.5 荧光显微镜检测。吸弃细胞培养板各孔中培养液，用PBS洗3次；4%多聚甲醛固定液固定15～20 min；洗3次。取出细胞爬片，固定后在荧光显微镜400倍视野下观察。

1.2.6 Western Blot分析。于细胞转染48 h后，弃去各孔培养基，PBS洗涤3次，每孔用150 μL细胞裂解液收集蛋白，12 000 r/min离心3 min，收集上清蛋白，-20 ℃保存备用。取蛋白样品加适量蛋白Loading Buffer，沸水煮3 min，冷却后用10%分离胶的SDS-PAGE电泳，随后转至硝酸纤维素膜（PVDF），封闭后分别以1 ∶4 000的GFP蛋白单克隆抗体和1 ∶100稀释的一抗血清37 ℃孵育2 h，1 ∶5 000稀释的二抗HRP-羊抗鼠IgG孵育2 h，充分洗涤后适量显色液显色，并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 基因的扩增

分别以重组质粒pMD18-T- B-F-HN346-353和pMD18-T-B-Fβ2m-α为模板进行扩增，琼脂糖电泳检测。结果分别获得了150 bp和1 334 bp的目的基因片段Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3和B-Fβ2m-α，与预期条带大小相等（图1和2）。

3基因的PCR产物；3.阴性对照

Note： M.DL2000 DNA Marker；1 and 2.PCR products of Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3 gene；3.Negative control

图1 Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3基因的PCR扩增

Fig.1 PCR amplification of Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）3 gene

注： M.DNA 标准分子量；1～4.B-Fβ2m-α基因的PCR产物；5.阴性对照

Note： M.DL2000 DNA Marker；1-4.PCR products of Leader（β2m）-HN346-353-Linker（G4S）33 gene；5.Negative control

图2 B-Fβ2m-α基因的PCR扩增

Fig.2 PCR amplification of B-Fβ2m-α gene

2.2 pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α重组质粒的构建及鉴定

以筛选的阳性重组质粒pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α为模板，以及相应引物进行PCR扩增，初步鉴定重组质粒。阳性重组质粒分别用内切酶Nhe Ⅰ 和Hind Ⅲ，Nhe Ⅰ 和Sal Ⅰ 酶切，结果在分子量约为150 bp和1 484 bp处有预期DNA条带（图3）。重组质粒送生物公司测序，序列比对结果与目的基因完全一致，表明重组质粒构建成功。

2.3 重组质粒在真核细胞中的表达

分别用空质粒pEGFP

-N1、重组质粒pEGFP-HN346-353-B-Fβ2m-α转染293T

细胞，24 h后用荧光显微镜观察。结果空载体、重组载体的转染效果良好；空质粒pEGFP-N1表达的绿色荧光蛋白均匀分布于整个细胞，而重组质粒表达的融合蛋白则主要表达定位于293T细胞的内膜系统（图4）。

2.4 Western Blot检测分析

空载体和重组载体的细胞裂解液上清经SDS-PAGE分離后，转至PVDF膜上，分别与鸡MHC Ⅰ α和荧光蛋白GFP的相应一抗反应。以荧光蛋白GFP抗体为一抗的反应，结果可见分子量约为27.0 ku和86.4 ku的特异性反应带，与预期GFP标签荧光蛋白和HN346-353-B-Fβ2m-α融合蛋白大小一致；以鸡MHC Ⅰ α蛋白抗体为一抗的反应，结果可见大小约86.4 ku的特异性反应带，而空载体转染的细胞相应位置未见条带（图5）。表明融合蛋白与相应抗体发生了特异性结合，具有较好的免疫学活性。

3 结论与讨论

在免疫系统中，MHC Ⅰ 类分子最重要的功能是与被提呈的抗原肽分子结合，以抗原肽-MHC复合物的形式表达于抗原提呈细胞的表面，诱导机体产生T细胞免疫应答。研究发现，MHC Ⅰ 分子α和β2m链的组装，及其与抗原肽的稳定结合，对于MHC Ⅰ 分子成功呈递抗原肽、刺激机体产生免疫应答具有极其重要的意义[12-13]。因此，如果通过一段短的连接肽将三者以共价键的方式串联，将更有助于MHC Ⅰ 类分cDNA序列与小鼠的MHC Ⅰ 类分子连接，构建了OVA-β2m-Kb的融合基因，结果表明，该结构能更有效地引起抗原特异性T细胞免疫。Kim等[15]将小鼠的MHC Ⅰ 类通过一段短肽与李斯特氏菌的抗原短肽连接，形成稳定表达的SCT结构，同样能有效地诱导机体产生T细胞应答反应。相对普通MHC Ⅰ 类分子，在抗原肽-MHC Ⅰ 类分子的SCT结构中，α和β2m链被共价键连接，不需要重新组装；同时被固定的抗原短肽，可避开其他抗原肽的竞争，与MHC Ⅰ 类分子复合体更稳定地在细胞表面表达，也因此能更好地刺激T细胞免疫应答[16]。该结构对于抗病毒及抗肿瘤等的免疫治疗具有重要意义[17-18]，此外该特点也为MHC Ⅰ 类分子呈递外源性抗原肽提供了可能性。

研究发现，在融合基因中连接肽既要合适的氨基酸长度，又要有较好的疏水性和伸展性，其中含Gly-Ser单位，尤其是以（Gly4Ser）3和（Gly4Ser）4长度序列的连接肽，已被较多地用于构建融合蛋白[19-20]。笔者前期通过连接肽（G4S）3 将鸡B-F分子的α和β2m链成功偶联，形成了稳定的二聚体。由于与MHC Ⅰ 类分子结合的肽，通常是长度为8～11个氨基酸的伸展状短肽，该研究选用8个氨基酸的新城疫病毒抗原表位短肽HN346-353（DEQDYQIR）[21]。通过连接肽（G4S）3，将细胞表位短肽HN346-353加载于鸡B-F分子二聚体，成功构建了HN346-353-B-Fβ2m-α单链三聚体。真核表达后荧光观察发现，该单链三聚体结构能够稳定表达，定位于细胞内膜系统；Western Blot检测结果显示，该聚合体能够识别相应特异性抗体，具有良好生物活性，可进一步用于以MHC Ⅰ 类分子为基础的疫苗载体，以及外源性抗原肽呈递的研究。

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