免疫分析技术在兽药残留检测中的有效利用

拜锦美+洪加平+成强+陈京都+吴红军

摘要：以胶体金免疫层析法为研究方法，研究免疫分析技术在兽药残留检测中的应用效果。建立一种用于快速检测动物制品中磺胺类药物的胶体金免疫层析法，检测动物制品中磺胺类药物残留。胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒直径为20 mm的胶体金纤维素膜，对待测样品中的磺胺类药物羽包被抗原中竞争集合胶体金标记抗磺胺类药物多克隆抗体相结合，用肉眼观察检测线颜色深浅变化。采用该种检测手段，对猪肉、肌肉和鱼类样品进行简单提取和稀释之后，就能够直接开始检测。视觉检测限度为0.01 mg/kg，检测时间在10 min以内，操作简便，灵敏性较高。胶体金免疫层析法具有较高的灵敏性和特异性，整个操作过程简单，容易操作，检测结稳定，可以作为磺胺类药物现场检查使用，在今后的动物兽药残留检测中值得推广应用。

关键词：胶体金层析法；兽药残留；应用

拜锦美，洪加平，成 强，等. 免疫分析技术在兽药残留检测中的有效利用[J]. 农业工程技术，2017，37（08）：14+17

进入新世纪以来，畜牧产业不断向前发展，兽药在畜牧产业中的应用范围和应用频率在逐年增加，其在防控多种疾病，促进畜禽动物健康生长、提高饲料利用率和改善畜禽产品质量以及品质方面发挥着十分重要的作用，逐渐成为未来现代化畜牧产业发展不可或缺的生产资料。

但是畜牧行业在使用兽药过程中还存在很多问题，大剂量、多种类的过度使用，导致了动物体内的药物积累量不断提升，在整个动物养殖周期内，动物很难全部将其代谢出去。消费者在购买了药物残留的畜禽产品之后，将过量的药物引入人的体内，最终导致人药物蓄积，给肝肾造成严重负担。

现阶段，动物制品药物残留已经成为制约畜牧产业可持续发展的关键性因素。为了解决兽药残留问题，本次研究过程中建立了一种用于快速检测兽药残留的胶体金层析检测法。

1 试验方法和试验材料

1.1 试验材料和仪器

试验材料：氯金酸、磺胺异噁唑、磺胺噻唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲二唑、聚乙二醇、牛血清白蛋白、羊抗兔IgG、抗磺胺类多克隆抗体、磺胺类半抗原[1]。

仪器：硝酸纤维素膜、蛋白纯化仪、紫外/可见分光光度计、样品垫、胶体金结合垫、吸水垫、PVC 衬板、划膜仪、切条机[2]。

购于市场的猪肉、鸡肉和鲫鱼，液相仪器检测为不含磺胺类药物的阴性样品。

1.2 胶体金免疫层析试纸条制备

首先，采用免疫亲和层析法对磺胺类药物多克隆抗体进行纯化；其次，胶体金制备[3]。将100 mL0.01%的氯金酸用恒温电磁搅拌器加热到沸腾，加热搅拌的同时向其中添加2 mL1%的柠檬酸三钠，当溶液变为无色继续搅拌8 min，冷却到室温环境下，向其中加入双蒸水回复到原来体积，在4℃的冰箱中保温。

胶体金1 mL，用0.2 mol/L的碳酸钾溶液调节胶体pH值到9.0，一边搅拌一边加入抗磺胺类多克隆抗体28 ?g，充分搅拌2 min后静置50 min，再向其中添加10 mL浓度为20%的聚乙二醇和20 ?L浓度为20%牛血清蛋白溶液，充分搅拌1 min，4℃离心3 min处理，将上层100 ?L清夜去除，然后保存。

配制金标抗体稀释液。100 mL双蒸水加入12 g的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1 mLTween-20，1 g的牛血清蛋白和0.5 mL的聚乙二醇以及0.5 mL含量为10%的叠氮钠溶液。

胶体金免疫层析条制备[4]。将包被好的磷酸盐缓冲溶液稀释为原来浓度的1、2、4、6、8倍，将划膜仪器的参数设定为0.6、0.8、1.0、1.2 ?L/cm，划膜干燥后使用金标抗体按照1：4、1：8、1：10、1：12、1：15的比例稀释，观察试纸条控制线和检测线的长度以及颜色变化情况；最后，准确称量猪肉、鸡肉和鱼肉2 g，切碎后放入试剂瓶中加入0.5 mL和1.5 mL的甲醇和PBST溶液，均匀搅拌后过滤，得到的滤液用磷酸盐缓冲溶液稀释10倍[5]。

2 结果分析

2.1 胶体金测试条灵敏度分析

将待测样品滴入样品垫上，由于毛细管作用，样品中的磺胺类药物和固定在显色中的包被抗原竞争结合胶体金标记的抗体相结合，磺胺类药物的含量越高，与抗体结合的越少，从而使得检测线的周围和空白对照区域颜色较浅。检测线所固定的包被抗原所结合的金标抗体少于一定数量的话，检测线颜色就会消失，而质控线会始终显示红色。通过对8种磺胺类药物进行测试发现，前五种的检测灵敏度较高，所以本次研究过程中选择使用磺胺异噁唑、磺胺噻唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪作为研究药物。详细情况见表1所示。

2.2 猪肉、鸡肉和鱼肉样品检测结果分析

将上述五种磺胺类药物分别添加到上述猪肉、鸡肉和鱼肉样品中，最终浓度为0、0.01、0.05、0.1 mg/kg[6]，并按照上述测试方法对样品滤液进行处理，得到了如图1所示。通过对图1进行分析发现，磺胺异噁唑、磺胺噻唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪五种磺胺类药物在猪肉、鸡肉和鱼肉中视觉检测标准为0.01 mg/kg。同时对氯霉素、莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、恩诺沙星的检测结果显示，上述物质浓度在1000 mg/mL时不存在交叉反应，本次试验制备的试纸条对磺胺类药物有较强的特异性。

3 讨论

胶体金层析法在应用过程中，胶体金的制备十分关键，胶金粒的大小是否均匀一致是判断胶体金稳定性的主要指标，如果胶体金颗粒直径变异范围过大，就会显著影响到试验的稳定性和重复性，如果颗粒形状不规则，蛋白固定不紧固，会严重影响到检测结果[7]。

本次研究过程，在某农贸市场和超级市场中随机采集鸡肉样品250份，用胶体金层析法进行检测，检测出11份鸡肉中含有磺胺类药物，其中8份鸡肉中磺胺类药物的浓度高达10-100 mg/g，有3份鸡肉磺胺类药物的浓度高达100 mg/g以上，效果比较显著。

本次试验过程中建立的胶体金层析法对五种磺胺类药物的残留进行了检测，并且磺胺异噁唑、磺胺噻唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪五种磺胺类药物残留检测和氯霉素、莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、恩诺沙星之间不存在交叉反应。在进行鸡肉、猪肉和鱼肉等制品药物残留检测过程中，方便快捷，视觉检测标准为为0.01 mg/kg，并且制备的试纸保存时间较久，操作容易，直接通过目测诊断，相信在今后的兽药残留检测会有更好的应用。

参考文献

[1] 郭 浩，王燕飞，邹明强，等. 农兽药多残留检测方法的研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2012（01）.

[2] 王玉金，胡宜亮，杨书豪，等. 氯霉素残留胶体金免疫层析快速检测法的研制[J]. 河南科学，2011（12）.

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[4] 李超辉，陈雪岚，郭 亮，等. 胶体金免疫层析法定量检测猪肉中克伦特罗[J]. 食品与发酵工业，2013（04）.

[5] 柳爱春，刘 超，赵 芸，等. 免疫胶体金法快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物的研究[J]. 浙江农业学报，2013（01）.

[6] 姜金庆，杨雪峰，王自良，等. 克伦特罗和莱克多巴胺多残留胶体金免疫层析试纸条的研制[J]. 畜牧兽医学报，2013（01）.

[7] 趙正苗，罗晓琴，汪善良，等. 应用胶体金免疫层析法检测动物组织中呋喃西林代谢物的残留[J]. 上海畜牧兽医通讯，2012（05）.