液相色谱-柱后衍生-原子荧光联用测定8种砷化合物

张奕宁，章寒英，赵红波，杨 洋，方振宇

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 311305；2.赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310030）

液相色谱-柱后衍生-原子荧光联用测定8种砷化合物

张奕宁1，2，章寒英1，2，赵红波1，2，杨 洋1，2，方振宇1，2

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 311305；2.赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310030）

应用高效液相色谱-柱后衍生-原子荧光光谱联用法，建立了食品和饲料中三价砷、五价砷、一甲基胂酸、二甲基胂酸、洛克沙胂、4-氨基 -苯胂酸、4-硝基 -苯胂酸、4-羟基 -苯胂酸8种食品和饲料中比较常见的砷化合物的检测方法。样品通过稀硝酸热浸提后，用正己烷脱脂净化，通过汉密尔顿 PRP-X100 阴离子交换柱或 CNW Athena C18 色谱柱分离，在无机砷化合物10～40μg/L，有机砷化合物 20～600μg/L 浓度内线性良好，相关系数大于 0.99，在无机砷添加 10μg/L、20μg/L，有机砷化合物添加 20～300μg/L 的添加水平下，平均回收率 80.3%～101.3%，相对标准偏差小于 5%，检测限 0.001～0.07 mg/kg。该方法简单、快速、准确，并兼顾了 GB 5009.11-2014 中对于无机砷检测的需求。

液相色谱—柱后衍生—原子荧光；联用；砷化合物；食品及饲料

现代医学的研究认为，砷剂的毒性与其化学形态关系极大。WTO 分别于1978年、1980年、1982年确认无机砷属于第一类致癌物。而与无机砷不同的是，自然界天然合成的一系列有机砷化合物以及人类合成的一些有机砷药剂则具有较小的毒性和致癌性，如4-氨基 -苯胂酸、4-羟基 -苯胂酸、4-硝基 -苯胂酸、洛克沙胂（3-硝基 -4-羟基 -苯胂酸）等在农业上是效果很好的禽类抗病制剂。藻类、瓣鳃纲、十足目，则或因自身合成，或因食物链，则造成了一甲基胂酸、二甲基胂酸、胂糖、胂胆碱、胂甜菜碱等有机砷化合物较高的含量所以在对于食品中的砷的含量水平很早就进入了形态分析的概念。

本方法应用高效液相色谱 -柱后衍生 -原子荧光光谱联用法，通过优化色谱条件和前处理方式，建立了食品和饲料中三价砷、五价砷、一甲基胂酸、二甲基胂酸、洛克沙胂、4-氨基 -苯胂酸、4-硝基 -苯胂酸、4-羟基 -苯胂酸8种食品和饲料中比较常见的砷化合物的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 设备

北京吉天 SP-20形态分析仪 -联用原子荧光主机 AFS8220。色 谱柱 ：汉密尔顿阴离子交换柱 PRP-X100（含 保护柱）、CNW Athena C18 色谱柱（含保护柱）。奥豪斯 AR224CN 分析天平。上海安亭 TDL-40B 离心机。超声水浴。抽滤设备。海能 SH230N 消解炉。milli-Q 纯水仪。

1.1.2 试剂

硝酸，优级纯。硼氢化钠，分析纯。过硫酸钾，分析纯。氢氧化钠，分析纯。磷酸氢二铵，分析纯。甲醇，色谱纯。乙酸铵，分析纯。

1.1.3 标准物质

三价砷标准溶液 ：生产公司 inorganic ventures，砷浓度1 000±5μg/mL。五价砷标准溶液 ：生产公司 O2SI，砷浓度1 000±3μg/mL。一甲基胂酸标准溶液（GBW08668）：生产公司中国计量科学研究院，浓度 0.335μmol/g。二甲基胂酸标准溶液（GBW08669）：生产公司中国计量科学研究院，浓度 0.233μmol/g。4- 氨 基 - 苯 胂 酸 ：Dr.Ehrenstorfer 生 产， 含量 99%。4-羟 基 -苯 胂 酸 ：CNW 生 产， 含 量 ＞98%。4-硝基 - 苯 胂 酸 ：Dr.Ehrenstorfer 生 产， 含 量 99%。 洛 克 沙 胂 ：Dr.Ehrenstorfer 生产，含量 99%。

各标准物质分别配置成5μg/mL 左右的水溶液，于4℃中避光保存。用水配置成不同浓度系列的标准工作溶液。

1.2 实验条件

1.2.1 样品前处理

称取 2g 经粉碎后的试样加入 20mL 1%（V/V）硝酸，于90℃加热 2.5h，期间每 30min 摇匀一次。样液冷却后于 3 000r/ min 离心5min 后取上清液，用正己烷10mL 脱脂2次。用0.45μm有机滤头滤入进样瓶中封装。

1.2.2 色谱条件

（1） 阴离子交换液相色谱（适用于测定三价砷、二甲基胂酸、一甲基胂酸、4-氨基 -苯胂酸、五价砷、4-羟基 -苯胂酸、洛克沙胂）。

色谱柱 ：汉密尔顿阴离子交换柱 PRP-X100（含保护柱）。

进样量 ：满环（100μL）。

流动相 A ：8 mmol/L 磷酸氢二铵水溶液。

流动相 B ：320 mmol/L 磷酸氢二铵水溶液。

（2） C18柱交换液相色谱（适用于测定4-硝基 -苯胂酸）。

色谱柱 ：CNW Athena C18 色谱柱（含保护柱）。

进样量 ：满环（100μL）。

流动相 A ：20mmol/L 乙酸铵水溶液。

流动相B：甲醇。

B% ：12%（0min）→ 12%（32min）

1.2.3 仪器测定条件与柱后衍生条件

原子荧光条件 ：载气流量 300mL/min，屏蔽气 500mL/min，光电倍增管负高压300V，总电流80mA，辅电流35mA。

衍生条件：

紫外灯在线消解开启。

衍生剂 1：1% 过硫酸钾 -0.35% 氢氧化钠溶液（300mL/h）。

衍生剂2 ：7% 硝酸载流溶液（500mL/h）。

衍生剂3 ：空气（300mL/h）。

衍 生 剂 4 ：4% 硼 氢 化 钠 -0.35% 氢 氧 化 钠 还 原 剂 溶 液（300mL/h）。

2 结果与讨论

2.1 提取的优化

测定这8种砷化合物。通过对1% 硝酸溶液热提取、10%硝酸溶液热提取、1% 盐酸溶液热提取等方法进行了比较，1%硝酸提取作为前处理方式引入的砷背景含量最低，而且提取效果较好，且不易造成砷化合物之间的转化。

2.2 色谱条件的优化

由于三价砷（亚砷酸根）、五价砷（砷酸根）极性很强，所以本方法采用了参考国标无机砷的做法，采用阴离子交换柱的方式分离。采用由低到高的磷酸盐浓度梯度洗脱，使7种砷化合物能够在25min 内出峰完全。

在实验中发现，汉密尔顿 PRP-X100阴离子交换柱在磷酸氢二铵作为流动相进行洗脱时，对含硝基的化合物有很强的吸附性。洛克沙胂（3-硝基 -4-羟基 -苯胂酸）在该320mmol/ L 磷酸氢二铵洗脱近 10min 才出峰，而 4-硝基 -苯胂酸用320mmol/L 磷酸氢二铵洗脱超过 40min 依然没有出峰。

改用 C18色谱柱，则三价砷、五价砷无法分开。因此采用阴离子交换柱为主，测定7种砷化合物，用 C18交换柱单独测定4-硝基 -苯胂酸的方式进行测定。

2.3 仪器条件的优化

仪器条件主要通过调节光电倍增管电压、灯电流的方式改变衍生条件，以改变不同砷化合物的响应能力。根据实验，在不使用紫外灯在线消解、仅仅使用7% 硝酸载流溶液与4%硼氢化钠 -0.35% 氢氧化钠还原剂溶液进行衍生时，只能测出三价砷、二甲基胂酸、一甲基胂酸、五价砷，其余四种砷化合物完全没有响应。使用紫外灯在线消解、使用7%硝酸载流溶液、4% 硼氢化钠 -0.35% 氢氧化钠还原剂溶液、空气、水进行衍生时，三价砷、二甲基胂酸、一甲基胂酸、五价砷信号没有变化，而其余四种砷化合物只能获得很低的响应强度。故最终采用了 1.2.3 中所提的仪器测定的相关条件。

以阴离子交换柱进行测定，各物质出峰时间为：三价砷 2.89min， 二 甲 基 胂 酸 4.16min， 一 甲 基 胂 酸 6.05min，4-氨 基 - 苯 胂 酸 10.54min， 五 价 砷 11.40min，4- 羟 基 - 苯 胂 酸12.80min，洛克沙胂 20.30min。以 C18 柱进行分离，4- 硝基 -苯胂酸出峰 11.42min。

2.4 线性关系及检出限的考察

在本文所确定的测定条件下，对该8种化合物进行测定。以保留时间进行定性，以响应峰面积进行定量。用浓度和对应的响应峰面积进行线性回归，所得线性范围及检出限如下：

三价砷（As 计），线性范围 0～40.0μg/L，工作曲线方程I=4 371.3 * C-4 580.9，线性度 0.997 756，方法检出限 0.009 41

mg/kg。二甲基胂酸，线性范围 0～78.0μg/L，工作曲线方程I=2 924.1 * C+946.9， 线 性 度 0.999 299， 方 法 检 出 限 0.01486 mg/kg。一甲基胂酸，线性范围 0～80.4μg/L，工作曲线方程I=3 028.3 * C-13 297.9，线性度 0.993 310，方法检出限 0.012 65 mg/kg。4- 氨基 - 苯胂酸，线性范围 0～257.6μg/L，工作曲线方 程 I=1 061.6 * C-16 427.6， 线 性 度 0.992 470， 方 法 检 出 限0.038 38mg/kg。 五 价 砷（As 计 ）， 线 性 范 围 0～40.0μg/L， 工作曲线方程 I=4 911.3 * C-104 48.6，线性度 0.993 538，方法检出限 0.008 88mg/kg。4- 羟基 - 苯胂酸，线性范围 0～260.8μg/L，工作曲线方程 I=1 402.8 * C-21 057.2，线性度 0.991 618，方法检出限 0.032 59mg/kg。洛克沙胂，线性范围 0～600.0μg/L，工作曲线方程 I=658.9 * C-23 602.5，线性度 0.992 042，方法检出限 0.062 40 mg/kg。4- 硝基 - 苯胂酸，线性范围 0～252.8μg/L，工作曲线方程 I=1 912.9 * C-11 485.9，线性度 0.998 618，方法检出限 0.024 85mg/kg。

2.5 方法回收率及精密度验证

对阴性样品进行3次浓度加标回收率实验，考察回收率及精密度，结果如下：

三价砷（As 计），加标浓度 1.00/10/20μg/L，回收率 86.6%/ 91.1%/96.6%，RSD 2.8%～3.5%。二甲基胂酸，加标浓度1.95/19.5/ 39μg/L， 回 收 率 82.1%/92.1%/98.1%，RSD 2.5%～2.8%。一 甲 基 胂 酸， 加 标 浓 度 2.01/20.1/40.2μg/L， 回 收 率80.3%/90%/96.7%，RSD 3.0%～3.7%。4- 氨 基 - 苯 胂 酸， 加标 浓 度 6.44/64.4/128.8μg/L， 回 收 率 91.6%/94.4%/95.8%，RSD 3.3%～3.8%。五 价 砷（As 计），加 标 浓 度 1.00/10/20μg/ L， 回 收 率 95.7%/98.2%/101.3%，RSD 2.0～2.8%。4- 羟基 - 苯 胂 酸， 加 标 浓 度 6.52/65.2/195.6μg/L， 回 收 率 83.3%/ 92.5%/98.2%，RSD 2.9%～3.3%。 洛 克 沙 胂， 加 标 浓 度7.5/150/30μg/L， 回 收 率 81.1/91.1/98.5%，RSD 3.8%～3.9%。4- 硝 基 - 苯 胂 酸， 加 标 浓 度 3.16/63.2/126.4μg/L， 回 收 率80.5%/92.8%/98.6%，RSD 2.1%～3.0%。

可见平均回收率 80.3%～101.3%，相对标准偏差小于 5%，具有较高的准确度和精密度。

对阳性饲料样品（总砷 5.2mg/kg）进行测定，结果为三价砷（As 计）0.590mg/kg，4-氨基 -苯胂酸 1.45mg/kg。

3 结论

本文建立并优化了三价砷、五价砷、一甲基胂酸、二甲基胂酸、洛克沙胂、4-氨基 -苯胂酸、4-硝基 -苯胂酸、4-羟基-苯胂酸的测定方法。该方法有效测定范围内线性良好，检出限为 0.001-0.07mg/kg， 精 密 度 为 2.5%～3.9%， 回 收率在80.3%～101.3%，具有较高的准确度和精密度。

[1] GB 5009.11-2014，食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定[S].

Determination of 8 Arsenic Compounds by LC-AFS

Zhang Yi-ning，Zhang Han-ying，Zhao Hong-bo，Yang Yang，Fang Zhen-yu

A method for the detection of trivalent arsenic，pentavalent arsenic，MMA，DMA，loxacridone，4-amino-arsenic，4-nitro-phenylarsine acid，4-hydroxy-phenylarsinic acid in food and feed were established by LC-AFS.The samples were purif i ed by dilute nitric acid and then degreased with n-hexane，separated by Hamilton PRP-X100 chromatographic column or CNW Athena C18 chromatographic column.The inorganic arsenic compound was 10-40 μg/L，the organic arsenic compound 20-600 μg/L.The average recoveries were 80.3-101.3%，the relative standard deviations were less than 5%，The method is simple，rapid and accurate，and takes into account the demand for inorganic arsenic detection in GB 5009.11-2014.

LC-AFS ；arsenic compound ；food and feed

TS210.7

：B

：1003–6490（2017）07–0182–02

2017–05–22

张奕宁（1989—），男，浙江杭州人，助理工程师，主要研究方向为化学分析。