肝癌HepG2细胞分泌的Exosome对间充质干细胞分化的影响及其相互作用机制

骆 飞，孙 昭，韩 钦，薛春玲，白春梅

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肿瘤内科，北京 1000522中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所组织工程中心，北京 100005



·论 著·

肝癌HepG2细胞分泌的Exosome对间充质干细胞分化的影响及其相互作用机制

骆 飞1，孙 昭1，韩 钦2，薛春玲2，白春梅1

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肿瘤内科，北京 1000522中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所组织工程中心，北京 100005

目的 评估肝癌HepG2细胞分泌的Exosome对间充质干细胞(MSC)分化为肿瘤相关成纤维细胞(CAF)的影响及其相互作用机制。方法 在人脂肪MSC培养体系中加入HepG2细胞分泌的Exosome进行培养，采用Western blot法检测CAF特征性蛋白的表达情况。将已鉴定为CAF样条件培养基(CAF-CM)和牛血清白蛋白对照组分别加至HepG2培养基中，采用Western blot法和定量PCR检测上皮间质转化相关基因的表达，MTS法检测细胞增殖，Transwell法检测HepG2细胞的迁移和侵袭。结果 HepG2细胞分泌的Exosome表达CD63、热休克蛋白(HSP)70和HSP90。将Exosome加入MSC培养体系后14 d，可检测到α平滑肌肌动蛋白、成纤维细胞激活蛋白α、白细胞介素(IL)- 6、IL- 8和IL- 1β等CAF特征性蛋白的表达。MTS法检测CAF-CM组的细胞增殖OD值为1.075±0.104，明显高于对照组的0.874±0.066(P=0.023)和MSC条件培养基组的0.649±0.034(P=0.0005)。CAF-CM组迁移的HepG2细胞数为(42.5±9.1)个，明显高于对照组的(18.5±3.1)个(P=0.001)；CAF-CM组侵袭细胞数为(29.0±3.5)个，明显高于对照组的(13.1±3.7)个(P=0.009)。CAF-CM组Smad交互蛋白1(P=0.040)、β-catenin(P=0.038)、纤连蛋白(P=0.029)和Vimentin(P=0.013)的表达较对照组显著上调；而CAF-CM组的紧密连接蛋白表达显著低于对照组(P=0.010)。结论 肝癌HepG2细胞系分泌的Exosome可诱导脂肪组织来源的MSC分化为CAF，后者又可以促进HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭。

Exosome；间充质干细胞；肝癌；肿瘤相关成纤维细胞

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：312-317

肿瘤微环境中的非肿瘤细胞对肿瘤的发生发展起到重要作用，肿瘤相关的肌成纤维细胞(cancer-associated myofibroblasts，CAF)是肿瘤微环境中最常见的非肿瘤细胞，在肿瘤的生长、转移、血管新生和基质形成中扮演重要角色[1- 2]。目前研究认为，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可能是CAF的主要来源[3]。有证据支持肝癌细胞可以促进MSC向CAF转化，但其机制目前尚不完全清楚[4]。Exosome是由细胞分泌至胞外的囊泡样小体，可携带包括蛋白质、mRNA、miRNA等多种物质，以细胞间物质交换作为信号传递的途径[5- 6]。本研究评估了肝癌HepG2细胞分泌的Exosome对正常脂肪来源MSC分化的影响。

材料和方法

脂肪MSC的分离和培养 成人脂肪组织取自吸脂手术患者(北京协和医院整形外科)，供者为25～35岁的健康女性，均签订知情同意书。采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hanks洗去血细胞和麻醉药，0.2%Ⅱ型胶原酶消化1 h，再用D-Hanks洗涤2遍以除去胶原酶。离心收集细胞，以2×106/ml的密度接种于用含95% DMEM/F- 12(美国Gibco公司)+5%的FBS(美国Hyclone公司)+20 ng/ml 表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)+100 U/ml链霉素+100 U/ml青霉素的培养基中，37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱培养。1 d后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3 d半量换液。当细胞达70%～80%融合时，用0.125%胰蛋白酶- 0.01%EDTA常规消化传代。

肝癌HepG2细胞系培养及Exosome的提取 肝癌HepG2细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，培养体系为H-DMEM+10%FBS。常规消化传代。培养48 h后，更换为无血清的H-DMEM培养基，培养24 h后，收取上清并以800×g离心5 min、2000×g离心10 min以去除细胞。将上清液在0.1 mm孔径的聚醚砜滤膜过滤除去细胞碎片和大囊泡，随后以相对分子质量为100 000的滤膜(CentriPlus- 70，美国Millipore公司)过滤浓缩，上清液的体积从约250～500 ml降低至小于5 ml。然后使用70Ti转子(美国Beckman Coulter公司)将上清液在4℃以100 000×g超速离心1 h。将所得沉淀重悬于6 ml PBS中，并使用100Ti转子(美国Beckman Coulter公司)在4℃下以100 000×g超速离心1 h。

共聚焦显微镜检测HepG2细胞来源的Exosome进入MSC胞浆 将培养3～4代脂肪来源的MSC用pMSCVneo-eGFP慢病毒(美国Invitrogen公司)干扰，G418压力筛选，得到95%以上表达eGFP的MSC后，铺于直径3.3 cm的培养皿中，贴壁24 h后，加入DiI红色荧光染料染色的HepG2来源的Exosome，24 h后固定，Hoechest33342染细胞核，共聚焦显微镜下观察。

肝癌HepG2细胞分泌的Exosome诱导脂肪来源MSC的分化 MSC消化计数，以2×105/ml的密度接种于6孔板中，贴壁24 h，更换为DF12培养基，实验组加入100 ng/ml的HepG2细胞系来源的Exosome，对照组加入同样浓度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)培养14 d[7]，每3 d半量换液。诱导14 d的CAF和对照组细胞去上清，加含10%FBS的H-DMEM完全培养基，培养24 h，收集上清，离心去除细胞碎片，作为条件培养基。

总RNA抽提和定量PCR检测 Trizol法抽提总RNA，并反转录为cDNA，基因表达水平用定量PCR的SYBR法检测，内参为GAPDH。引物序列见表1。

总蛋白提取和Western blot检测 提取细胞或Exosome总蛋白，BCA法定量，各组取40 μg总蛋白进行10%SDS-聚丙烯凝胶电泳，并转到PVDF膜上，一抗CD63(美国Thermo Scientific公司)，热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)、β-肌动蛋白(均购自中国Proteintech Group)，白细胞介素(interleukin, IL)-1β、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、IL- 6、IL- 8(均购自英国Abcam公司)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纤维细胞激活蛋白α(fibroblast activation protein α，FAPA)、紧密连接蛋白(zonula occludens- 1，ZO- 1)、β-catenin、纤连蛋白(fibronectin，FN)、Vimentin、Smad交互蛋白- 1(Smad interacting protein 1，Sip- 1)抗体(均购自美国Santa Cruz公司)1∶1000 4℃过夜，内参为GAPDH(美国Santa Cruz公司)，二抗室温孵育1 h，ECL荧光显色，照相。

MTS法检测细胞增殖 将HepG2细胞以3×104/ml密度种入96孔U型板中，6 h后去上清，分别加入H-DMEM完全培养基(对照组)，BSA-MSC组条件培养基，CAF组条件培养基，培养3 d后，去上清，每孔加入100 μl无血清H-DMEM培养基和20 μl MTS，37℃孵育1 h后，490 nm酶标仪检测OD值。

细胞迁移和侵袭实验 迁移实验在Transwell(Costa)小室中进行，培养的细胞常规消化计数，用无血清培养基重悬，200 μl的细胞悬液(1×106个细胞/ml)后加入Transwell的上室，下室加入含10%FBS的H-DMEM培养基500 μl，培养 24 h左右后固定，结晶紫染色，显微镜下计数。侵袭实验是在 Transwell 小室内预先铺ECM胶，培养 72 h后固定，其他部分同迁移实验。

统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件，实验数据以均数±标准差表示，组间数据比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

HeG2来源的Exosome的鉴定 Western blot法检测结果显示，HepG2来源的Exosome可表达CD63、HSP70和HSP90(图1A)。透射电子显微镜下观察到 Exosome为30～100 nm的小囊泡结构(图1B)。

HepG2来源的Exosome可直接进入MSC的胞浆 HepG2来源的Exosome用DiI红色荧光染料染色后，加在eGFP-MSC培养体系中，培养24 h后固定，共聚焦显微镜观察发现MSC的胞浆中可见大量红色的Exosome分布(图2)。

表 1 定量PCR引物序列

A.Western blot检测结果；B.电镜图

A.Western blottling results；B.electron microscopy

图 1 HepG2来源的Exosome的特征

Fig 1 Characteristics of HepG2-derived Exosome

HepG2来源的Exosome可诱导MSC分化为CAF样细胞 将HepG2分泌的Exosome或BSA加入MSC培养体系后培养14 d，Western blot检测结果显示，加入Exosome实验组的IL- 1β、FAPA、α-SMA、IL- 6和IL- 8等CAF特征性蛋白的半定量相对蛋白灰度表达分别为1.27±0.22、0.98±0.08、0.70±0.02、1.42±0.13和0.67±0.06，显著高于对照组的0.99±0.05(t=5.53，P=0.03)、0.82±0.06(t=8.75，P=0.013)、0.56±0.04(t=6.902，P=0.02)、1.23±0.03(t=4.69，P=0.04)和0.51±0.05(t=15.4，P=0.004)，VEGF水平与对照组差异无统计学意义(t=3.96，P=0.058)(图3)。

CAF样细胞条件培养基对HepG2增殖的影响 将CAF细胞条件培养基(CAF-CM)和MSC条件培养基分别用于培养HepG2细胞，MTS法检测结果显示，CAF-CM组的OD值为1.075±0.104，明显高于对照组的0.874±0.066(t=3.22，P=0.023)和

MSC条件培养基组的0.649±0.034(t=7.89，P=0.0005)。

CAF样细胞条件培养基对HepG2迁移和侵袭的影响 迁移实验结果显示，CAF-CM组迁移过去的细胞数为(42.5±9.1)个，明显高于对照组的(18.5±3.1)个(t=11.55，P=0.001)。侵袭实验结果显示，CAF-CM组侵袭过去的细胞数为(29.0±3.5)个，也明显高于对照组的(13.1±3.7)个(t=6.06，P=0.009)。定量结果显示，CAF-CM组的Sip- 1、β-catenin、FN和Vimentin的基因相对表达(以对照组表达为1)水平分别为3.62±0.94(t=4.85，P=0.04)、2.11±0.39(t=4.96，P=0.038)、4.08±0.92(t=5.77，P=0.029)和6.19±1.04(t=8.56，P=0.013)，均较对照组显著上调；ZO- 1相对表达水平为0.45±0.09，显著低于对照组(t=-9.98，P=0.01)(图4)。

讨 论

肝癌是世界范围内最常见的肿瘤之一，目前以手术治疗为主，而对于晚期不能手术的患者，治疗手段有限。传统上肝癌对化疗和放疗不敏感，而靶向治疗受益的患者有限，肝癌治疗急需寻找新的治疗靶点。目前靶向药物研究不单只关注肿瘤细胞本身，也逐渐着眼于肿瘤所处的微环境。本研究评估了肝癌HepG2细胞分泌的Exosome对MSC分化的影响及其相互作用机制，以期肝癌治疗提供新的策略。

MSC：间充质干细胞

MSC：mesenchymal stem cell

A. Hoechest33342染色，细胞核发蓝色荧光；B. MSC表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFR)发出绿色萤光；C. Dil染色使Exosome发出红色荧光；D. 合成图

A. Hoechest33342 staining，see nuclei showed blue fluorescence；B.MSC express eGFP showed green fluorescence；C. Dil staining，Exosome showed red fluorescence；D. generated the three images together

图 2 共聚焦显微镜检测HepG2-Exosome可进入MSC的胞浆

Fig 2 Confocal laser scanning microscope shows that hepatoma cell-derived Exosome enter the cytoplasm of MSC

VEGF：血管内皮生长因子；FAPA：成纤维细胞激活蛋白α；α-SMA：α平滑肌肌动蛋白；IL：白细胞介素；CAF：肿瘤相关肌成纤维细胞

VEGF：vascular endothelial growth factor；FAPA：fibroblast activation protein α；α-SMA：α-smooth muscle actin；IL：interleukin；CAF：cancer-associated myofibroblasts

图 3 Western blot法检测HepG2-Exosome培养14 d后CAF特征性蛋白在MSC中的表达情况

Fig 3 Western blotting shows that the cells expressed the typical characteristic protein of CAF 14 days after culturing of HepG2 cell-derived Exosome

Sip- 1：Smad交互蛋白1；FN：纤连蛋白；ZO- 1：紧密连接蛋白

Sip- 1：Smad interacting protein 1；FN：fibronectin；ZO- 1：zonula occludens- 1

A.Transwell实验中CAF-CM促进HepG2细胞迁移和侵袭的显微镜下代表性结果(×200)；B.Western blot法检测CAF-CM对上皮-间质转化相关蛋白影响

A.microscopic image of crystal violet staining of Transwell(×200)；

B.the protein expressions of epithelial and mesenchymal makers in dealing with CAF-CM and control

图 4 CAF细胞条件培养基对HepG2细胞迁移和侵袭的作用

Fig 4 Effects of CAF-CM on cell migration and invasion of HepG2

有研究证实，胆管癌[8]、前列腺[9]、乳腺癌[10]、胃癌[11]、卵巢癌[12]等上皮来源的肿瘤细胞系分泌的Exosome可以诱导MSC(骨髓，脂肪，脐带等来源)中α-SMA表达显著升高，从而分化为功能性CAF，但是肝癌细胞是否有同样的作用则少见报道。本研究采用电镜和Western blot法检测了肝癌HepG2细胞来源的Exosome的特征，结果示镜下所见的Exosome为30～100 nm的小囊泡结构，可表达CD63、HSP70和HSP90抗体，提示成功提取了Exosome。已知CAF为存在于肿瘤间质中活化的成纤维细胞，其特异性标志物包括α-SMA、Vimentin和FAPA等[13]，肿瘤细胞可通过分泌可溶性因子诱导CAF的形成及活化。本研究结果显示，人脂肪来源MSC经HepG2-Exosome诱导分化后，α-SMA和FAPA等特征性蛋白表达显著，IL- 1β、IL- 6和IL- 8等细胞因子表达也显著增高，符合CAF的特点，证实肝癌细胞系HepG2可能通过Exosome促进脂肪来源MSC转化为CAF。此外，肿瘤细胞与CAF之间的作用是双向的，CAF活化后，能够分泌一系列细胞因子包括生长因子、趋化因子、IL- 6等，通过促进细胞外基质重塑、细胞增殖、血管生成、细胞迁徙及EMT等进一步维持肿瘤的进展[14- 15]。本研究通过增殖和迁移侵袭实验证实了CAF条件培养基能增强肝癌细胞系HepG2的增殖、迁移和侵袭能力，且通过Western blot检测和定量PCR验证了转化为CAF样细胞的培养基能诱导肝癌细胞上皮间质化，支持了CAF能促进肿瘤进展的观点。

综上，本研究结果显示，肝癌上皮细胞来源的Exosome可以诱导正常组织来源的MSC分化为有功能的CAF。若阻断MSC分化为CAF，可能有助于减缓肿瘤发展的进程，为肝癌等肿瘤治疗提供新的靶点。另外，Exosome中富含蛋白和非编码 RNA，可在细胞间传递多种信号分子，但其调控MSC分化的信号通路的机制尚不清楚，仍需进一步研究。

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Effect of Human Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cell-derived Exosome on theDifferentiation of Mesenchymal Stem Cells and Their Interaction

LUO Fei1，SUN Zhao1，HAN Qin2，XUE Chunling2，BAI Chunmei1

1Department of Oncology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100052，China2Center of Excellence in Tissue Engineering，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，ChinaCorresponding author：BAI Chunmei Tel：010- 69158315，E-mail：baichunmei1964@126.com

Objective To investigate the effect of human hepatocellular carcinoma HepG2 cell-derived Exosome on the differentiation of mesenchymal stem cells(MSC)into cancer-associated myofibroblasts(CAF)and the impacts of CAF on liver cancer cell proliferation，migration，and invasion. Methods The protein expression of HepG2 cell-derived Exosome was detected by Western blotting. MSCs were separated from human adipose tissue and cultured with HepG2 cell-derived Exosome(100 ng/nl)to initiate differentiation. The expressions of mesenchymal markers and several interleukins were also detected by Western blotting. HepG2 cells were co-cultured with the conditioned media(CM)，in which HepG2 Exosome induced the differentiation of MSC into CAF. The expressions of epithelial and mesenchymal markers were detected by real-time polymerase chain reaction(PCR)and Western blotting. Cell proliferation was assessed using MTS assay. Transwell chambers were used in theinvitromigration and invasion assay. Results HepG2 cell-derived particles expressed CD63，70 kilodalton heat shock proteins，and 90 kilodalton heat shock proteins. With the treatment of HepG2 cell-derived Exosome，the expressions of mesenchymal marker α-smooth muscle actin，fibroblast activation protein α，interleukin(IL)- 6，IL- 8，and IL- 1β were up-regulated，while vascular endothelial growth factor had no significant change. The conditioned media which HepG2 Exosome induced MSC differentiation CAF(CAF-CM)could significantly promote HepG2 cells proliferation(1.075±0.104)，compared to BSA control(0.874±0.066，P=0.023)and MSC-CM(0.649±0.034，P=0.0005). CAF-CM could significantly enhance cell migration [(42.5±9.1) cellsvs.(18.5±3.1) cells，P=0.001] and invasion [(29.0±3.5) cellsvs.(13.1±3.7) cells，P=0.009] compared to its control group. Moreover the conditioned medium which HepG2 Exosome induced MSC to differentiate into CAF could also promote the expressions of mesenchyme-related genes Smad interacting protein 1(P=0.040)，β-catenin(P=0.038)，fibronectin(P=0.029)，and Vimentin(P=0.013)and inhibit the expression of epithelial related genes zonula ocdudens- 1(P=0.010).Conclusions Exosome extracted from HepG2 cells can induce human adipose-derived MSC to differentiate into cancer-associated myofibroblasts. CAF-like cells can promote the migration of the liver cancer cell line HepG2.

Exosome；mesenchymal stem cells；liver cancer；cancer-associated myofibroblasts

国家自然科学基金(81472785、61435001)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81472785，61435001)

白春梅 电话：010- 69158315，电子邮件：baichunmei1964@126.com

R735.7

A

1000- 503X(2017)03- 0312- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.003

2016- 10- 08)