骨髓间充质干细胞输注对脓毒症大鼠促炎因子和心功能的影响

程仁洪，郑健新，张 伟 （福州总医院急诊科，福建 福州 350025）

骨髓间充质干细胞输注对脓毒症大鼠促炎因子和心功能的影响

程仁洪，郑健新，张 伟 （福州总医院急诊科，福建 福州 350025）

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）输注对脓毒症大鼠促炎因子和心功能的影响．方法：将BMSCs进行分离培养之后，选取24只成功建立脓毒症模型（盲肠结扎穿孔术，CLP法）的Wistar大鼠，依照随机数字法分成脓毒症组、间充质干细胞组以及上清液（间充质干细胞上层培养液）组各8只，另选8只接受假手术干预的Wistar大鼠作为假手术组，各组均经大鼠尾静脉注射给药干预1周，干预后以双抗体免疫夹心法检测血清肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）、肌钙蛋白、白介素⁃6（IL⁃6）、心肌匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量，同时在治疗后利用超声心动图评价各组小鼠的心功能．结果：间质干细胞组TNF⁃α（1253．701±326．960）pg／mL、肌钙蛋白（79．720±11．352）pg／mL、IL⁃6（747．596±33．184）pg／mL、LVDS（2．925±0．271）mm与上清液组TNF⁃α（1337．888±201．937）pg／mL、肌钙蛋白（83．923±14．491）pg／mL、IL⁃10（749．253 ±37．118）pg／mL、LVDS（3．013±0．236）mm显著低于脓毒症组（P＜0．05）．间质干细胞组SOD（108．199±20．081）U／mg、LVEF（77．125±1．808）%与上清液组SOD（109．691±18．609）U／mg、LVEF（77．750±1．669）%显著高于脓毒症组（P＜0．05），且与假手术组水平接近（P＞0．05）．结论：骨髓间充质干细胞输注能够改善脓毒症大鼠心功能，其作用机制可能与其能够调节炎症因子表达有关．

骨髓间充质干细胞；脓毒症；促炎因子；心功能

0 引言

脓毒症是严重烧伤、感染等急危重症者最常见的并发症，被认为是重症监护患者最主要的死亡原因［1－4］．目前关于脓毒症研究不断增多，临床已经证实感染、炎症反应、组织损伤、免疫功能等均能够影响脓毒症的转归，有效治疗脓毒症极为重要．骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）被证实具有心肌细胞转化能力，而且具有免疫调节能力．目前实验发现［6－9］BMSCs能够抑制脓毒症模型动物体内促炎细胞因子表达水平，在阻止炎症细胞组织浸润和氧化损伤的基础上，增强机体细菌清除效果，对于脓毒症有一定治疗效果．本实验通过观察BMSCs输注对脓毒症大鼠促炎因子、心功能的影响，初步分析了BMSCs输注治疗脓毒症的潜在价值．

1 材料和方法

1．1 实验动物 雄性清洁级别的Wistar大鼠，全部购自斯莱克实验动物公司．

1．2 仪器和试剂 洁净工作台（苏州安泰空气公司）、倒置显微镜（日本奥林巴斯）、二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技公司）、BMSCs完全培养基（澳赛尔斯生物技术公司）、TNF⁃α、IL⁃6等试剂（美国Sigma公司）、EDTA消化液（索莱宝科技有限公司）、胎牛血清（四季青生物有限公司）．

1．3 实验方法

1．3．1 脓毒症模型建立方法 大鼠编号并称量体重之后，按照20 mg／kg的剂量腹腔注射脂多糖毒素．假手术组注入物是等量生理盐水．

1．3．2 动物分组及干预方法 利用CLP法建立脓毒症模型，选取成功建立模型的24只Wistar大鼠，依照数字法分成脓毒症组、间充质干细胞组、上清液组各8只，另选8只接受假手术干预的Wistar大鼠作为假手术组，假手术组、脓毒症大鼠干预方法为在尾静脉注射生理盐水0．5 mL，间充质干细胞组注射物为骨髓间充质干细胞重悬溶液，密度为2×106个，上清液组注射物为骨髓间充质干细胞体外培养时的上层清液，注射量均为0．5 mL，术后干预1周．

1．4 观察指标

1．4．1 血清TNF⁃α、肌钙蛋白、IL⁃6检测 检测炎症因子（TNF⁃a、IL⁃6）、肌钙蛋白Ⅰ，检测步骤参照说明书，按步骤逐一进行，每个样本设2个复孔进行．

1．4．2 心肌匀浆SOD和MDA检测 ①制备匀浆介质：1 L超纯水，依次加入甘露醇 40．0774 g，蔗糖23．9603 g，HEPES 0．59575 g，EDTA 0．58448 g，搅拌，滴加数滴NaOH助溶，溶解后调pH至7．4；②10%心肌匀浆制备：称取100 mg心肌组织，剪碎后放入玻璃匀浆器中，按1∶9的比例加入9倍体积的匀浆介质，在冰浴条件下研磨30次．4℃，5000 g离心10 min，取上清．③心肌匀浆SOD检测：10%心肌匀浆稀释成0．5%心肌匀浆，考马斯亮蓝法（南京建成）测蛋白浓度，用总超氧化物歧化酶测试盒检测SOD（南京建成）．④心肌匀浆MDA检测：10%心肌匀浆稀释成0．5%心肌匀浆，考马斯亮蓝法（南京建成）测蛋白浓度，用丙二醛测试盒检测MDA（南京建成）．

1．4．3 心功能 阿洛卡F75型超声仪检测心动图，检测指标有左心室收缩末径（left ventricular systolic diameter，LVDs）和左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）．每只大鼠均连续测量3个心动周期的原始数据，并将平均值作为结果，该操作由经验丰富的超声科医生协助完成．

1．5 统计学处理 采用SPSS20．0统计学软件对数据进行分析，计量资料表达用±s，多组间分析用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验，P＜0．05表示差异具有统计学意义．

2 结果

2．1 组间血清学检测结果分析 血清炎症因子检测结果显示，脓毒症组血清TNF⁃α、肌钙蛋白、IL⁃6显著高于其他组，间质干细胞组、上清液组血清TNF⁃α、肌钙蛋白、IL⁃6虽然高于假手术组，但是组间比较，差异无统计学意义（P＞0．05，表1～3）．

表1 各组血清炎症因子表达水平（n＝8，pg／mL）

表2 各组血清炎症因子单因素方差分析结果

表3 各组血清炎症因子LSD多重比较

2．2 组间心肌SOD和MDA检测结果分析 假手术组心肌SOD显著高于其他组，而MDA显著低于其他组，脓毒症组心肌SOD显著低于间质干细胞组、上清液组，而各组间心肌MDA水平无显著性差异，表4～6．

表4 组间心肌SOD和MDA检测结果 （n＝8）

表5 组间心肌SOD和MDA单因素方差分析

表6 心肌SOD和MDA检测结果多重比较

2．3 组间心功能检测结果分析 脓毒症组LVEF显著低于其他组，而LVDS显著高于其他组，假手术组心肌、间质干细胞组、上清液组LVEF、LVDS水平无显著性差异，见表7～9．

表7 组间心功能检测结果（n＝8）

表8 心功能单因素方差分析

表9 心功能组间多重比较（n＝8）

3 讨论

脓毒症（sepsis）是感染、烧／创伤、休克等急危重患者的严重并发症，死亡率高达20%以上，如果出现休克，死亡率明显增加．心脏是脓毒症时最常见受累的器官．心功能障碍是脓毒症最严重的并发症，是导致脓毒症早期死亡的主要原因，且病死率随着年龄的增加而增加．因此，采取有效措施保护心功能、减轻心功能障碍是提高脓毒症救治成功率的重要措施［10－12］．

在脓毒症病情发展进程中，炎症反应贯穿始终．感染引起炎症因子大量释放，损伤内皮细胞，导致组织灌注压降低、白细胞／血小板黏附增加、纤维素沉积、红细胞刚性增加等一系列改变．组织灌注不足导致的缺氧又与炎症互为因果、相互促进，最终导致器官功能障碍、患者死亡．同时，脓毒症患者免疫系统失衡，也是导致其预后不佳的主要原因之一．因此，脓毒症治疗中抗炎治疗与免疫调理越来越受到关注．

本实验中通过构造脓毒症大鼠模型，发现实验动物肌钙蛋白和心脏收缩舒张功能都发生异常，提示脓毒症大鼠出现脓毒症心肌病，为后续实验打下基础．随后在不同干预方式下，研究各组大鼠的炎症因子表达水平，结果发现，间充质干细胞组、上清液组的促炎症因子TNF⁃α、IL⁃6表达水平显著低于脓毒症组，其表达量与假手术大鼠极为接近，说明间充质干细胞、间充质干细胞分泌物都能抑制过度炎症反应的作用．

超声心动图分析脓毒症大鼠心功能情况，发现在脓毒症条件下，大鼠的心功能出现肌钙蛋白升高、左室LVEF降低，表明脓毒症的确能造成实验动物心功能损伤．实验也发现间充质干细胞组、上清液组的超声心动图评价结果明显优于脓毒症组，说明间充质干细胞、间充质干细胞分泌物均能够改善心功能．这可能与间充质干细胞自身特点有关．间充质干细胞具有多向分化能力［13－16］，能够向心肌细胞转化，对损伤组织具有修复能力，并且能够通过自分泌途径、旁分泌途径产生抑制炎症反应和调控免疫功能的作用，因此，间充质干细胞和充质干细胞分泌物均有明显的治疗作用．但是本实验中充质干细胞组、上清液组MAD水平未见明显改善，这可能与干预时间短、组织损伤和线粒体损伤修复所需时间长有关，间充质干细胞组对于心肌线粒体功能的影响仍需长期大样本实验进行研讨．

线粒体是心肌获取能量的主要场所，线粒体结构和功能受损在心肌损伤的发生发展中有重要影响．SOD作为抗氧化金属酶能够反应机体清除氧自由基的能力，MAD作为脂质过氧化产物，能够反映组织氧化损伤程度和线粒体损伤程度，在一定程度上反应心肌损伤情况．本实验中分析各组大鼠SOD、MAD水平发现，脓毒症能显著降低机体抗氧化能力，同时造成组织细胞脂质过氧化损伤．而间充质干细胞及其上清液能够提高SOD水平，从而有效保护机体抗氧化能力，发挥保护脏器功能的作用．间充质干细胞组、上清液组的超声心动图评价结果明显优于脓毒症组，也和间充质干细胞及其上清液能抑制过度的炎症反应，减轻机体脂质过氧化损伤的机制有关．

综上所述，脓毒症大鼠通过过度的炎症反应、脂质过氧化损伤等机制损伤心脏功能．间充质干细胞及其细胞培养上清可以通过抑制过度炎症反应，减轻脂质过氧化损伤等功能实现改善脓毒症大鼠的心脏功能．

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Effects of bone marrow mesenchymal stem cells infusion on proinflammatory cytokines and cardiac function for septic rats

CHENG Ren⁃Hong，ZHENG Jian⁃Xin，ZHANG Wei Emergency Department of Fuzhou General Hospital， Fuzhou 350025，China

AIM：To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）infusion on proinflammatory cytokines and cardiac function for sepsis rats．METHODS：The BMSCs were isolated and cultured，and 24 Wistar rats were se⁃lected and established sepsis model successfully（cecal ligation and puncture，CLP）．According to the random number method，they were randomly divided into sepsis group，mesenchymal stem cells group and supernatant group（mesenchymal stem cells cul⁃tured upper supernatant），8 rats in each group．Another 8 Wistar rats with sham surgical intervention were selected as sham opera⁃tion group．Each group was given subcutaneous injection interven⁃tion for one week．After the intervention，the serum tumor necrosis factor⁃α（TNF⁃α），troponin，interleukin⁃6（IL⁃6）were detected by double antibody sandwich method．The superoxide dismutase（SOD）in myocardial homogenate and malondialdehyde（MDA）content were detected at the same time．After the treatment，cardi⁃ac function of each group was evaluated by echocardiography．RESULTS：In mesenchymal stem cells group，TNF⁃α（1253．701 ±326．960）pg／mL，troponin（79．720±11．352）pg／mL，IL⁃6（747．596±33．184）pg／mL，LVDS（2．925±0．271）mm and in su⁃pernatant group，TNF⁃α（1337．888±201．937）pg／mL，troponin（83．923±14．491）pg／mL，IL⁃6（749．253±37．118）pg／mL，LVDS（3．013±0．236）mm were significantly lower than those of sepsis group（P＜0．05）．In mesenchymal stem cells group，SOD（108．199±20．081）U／mg，LVEF（77．125±1．808）%and in supernatant group，SOD（109．691±18．609）U／mg，LVEF（77．750±1．669）% were significantly higher than those of sepsis group（P＜0．05），and which were close to the level of sham operation group（P＞0．05）．CONCLUSION：Bone marrow mesenchymal stem cells infusion can improve cardiac function of septic rats with sepsis and its mechanism may be related to its regulating of inflammatory factors expression．

bone marrow mesenchymal stem cells infusion；sep⁃sis；proinflammatory cytokines；cardiac function

2095⁃6894（2017）06⁃20⁃06

R459．7

A

2017－05－05；接受日期：2017－05－20

福建省自然科学基金（2013J1037）

程仁洪．硕士，主治医师．研究方向：急诊医学．E⁃mail：zh⁃easy＠163．com

张 伟．博士，副主任医师．研究方向：急诊医学．E⁃mail：zh⁃easy＠163．com