豆象干标本基因组DNA提取方法的改进

李金庆 鲁闽 粟智平 段效辉 王颖 孙超 卢经

摘要[目的] 筛选豆象干标本基因组DNA的有效提取方法。[方法] 以口岸截获时间不等的豆象干标本为材料，在传统方法上加以改进，对从干标本中提取豆象基因组DNA的方法进行了研究。将其所提取的基因组DNA的纯度和浓度与CTAB法和SDS法进行了比较，并对DNA进行了完整性及PCR验证。[结果] 与CTAB法和SDS法相比，豆象干标本提取方法提取的DNA OD260/OD280值均在1.7～1.9，且浓度合适。DNA完整性及PCR验证结果表明，豆象干标本提取方法比较适合后续PCR试验的开展。[结论] 豆象干标本提取方法适合该研究中豆象干标本基因组DNA的提取，可推广到检验检疫工作中截获豆象的检疫鉴定中，以缩短检验检疫工作周期，提高检验检疫工作准确性。

关键词豆象干标本；DNA提取；基因组DNA

中图分类号S412文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0123-03

Abstract[Objective] To select the effective DNA extraction method for dried samples of bean weevil insects.[Method] The method for extracting genome DNA was studied on the basis of traditional methods by using dried bean weevil insects of different intercepted times as materials.The purity and concentration of the extracted genomic DNA samples were detected and compared with CTAB and SDS method， then the extracted genomic DNA samples were further verified by the DNA integrity and PCR identification.[Result] Compared with CTAB and SDS method， the extracted genomic DNA samples had appropriate OD260/OD280 values between 1.7-1.9 and appropriate concentrations. The DNA integrity and PCR identification results showed that the genomic DNA extraction method for dried bean weevil samples was more suitable for subsequent PCR experiments. [Conclusion] Dried bean weevil DNA extration method is suitable for extrating bean weevil insectsgenomic DNA. This method can be extended to the quarantine and identification of intercepted bean weevil samples in CIQ work， in order to shorten the period and improve the accuracy of CIQ work.

Key wordsDried bean weevil sample；DNA extraction；Genomic DNA

近年來，分子生物學技术被大量应用于检验检疫工作中检疫性昆虫的鉴定等[1-5]，这些分子生物学鉴定技术快速有效，可有效弥补昆虫形态学鉴定中早期形态（包括卵、幼虫/若虫、蛹）与残缺虫体难以辨认、鉴定结果受主观影响大、鉴定周期较长等缺点[6]。进行分子生物学鉴定时，昆虫中有效基因组DNA的提取是鉴定成功与否的前提[7]。在以往的研究中，大多数研究者所用的昆虫基因组DNA 提取材料基本上是新鲜样品或超低温冷冻标本。但是在实际工作中，针对稀有类群或检疫对象经常面临难以得到新鲜材料的问题，往往需要利用标本馆或从其他渠道得到的干标本提取基因组DNA。由于干标本的保存时间越长，基因组DNA的降解也就越严重，而且由于虫体细胞严重脱水，给提取DNA带来了很大难度[8-9]。因此，研究如何从昆虫干标本中提取基因组DNA，对于分子生物学鉴定昆虫至关重要，决定着下游试验的安全与成效。

传统的昆虫基因组DNA提取方法有CTAB提取法、SDS法以及商品化基因组DNA提取试剂盒等。由于试剂盒价格较高且适用范围有限，因而其并不适合于每个实验室，其他方法虽然能够获得质量较高的DNA，但操作步骤较多，产率不是很高。且传统的昆虫基因组DNA提取前处理通常采用液氮研磨等方式，这种方法对于样本的损耗较大。当昆虫头数较少时，经过液氮研磨处理已经有了大量损耗，给后期DNA提取造成很大困难。尤其是在检验检疫实际工作中，截获的检疫对象经常是数量较少，而且还有保留标本的要求，用液氮研磨等传统方式，会造成样本浪费和试验效果不理想。笔者选用口岸中常截获的检疫性及常见重要豆象作为研究对象，对标本的处理方式和基因组DNA的提取方法进行改进，并与传统DNA提取方法——CTAB法、SDS法进行对比，形成一套经济、高效的方法，为豆象进行准确分子鉴定提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料试验所用豆象材料均为干制标本，年份为5～25年不等，包括绿豆象（Callosobruchus chinensis L.）、鹰嘴豆象（Callosobruchus analis Fabricius）、四纹豆象（Callosobruchus maculates Fabricius）、菜豆象（Acanthoscelides obtectus Say）、花生豆象（Caryedon serratus Olivier）、巴西豆象（Zabrotes subfasciatus Boheman）、紫穗槐豆象（Acanthoscelides pallidipennis Motschusky）。试验材料为烟台出入境检验检疫局多年来在口岸的截获标本，部分由中国检验检疫科学院（北京）植物检疫所提供。

1.2豆象干标本DNA提取方法将干标本在STE缓冲液（0.10 mmol/L NaCl、10.00 mol/L Tris-Cl、1.00 mmol/L EDTA，pH=8.0）[10]中浸泡过夜，去离子水冲洗，晾干。称取0.06 g标本（豆象干标本3～4头）于2 mL玻璃研磨器中，再加入300 μL CTAB提取液（20 g/L CTAB、0.10 mol/L Tris-Cl、0.02 mol/L EDTA、1.45 mol/L NaCl，pH=8.0）研磨至細腻粉末状。将研磨液转移到2 mL离心管中，用CTAB提取液补充至600 mL，再加12 μL β-巯基乙醇，充分混匀。离心管置于65 ℃恒温水浴锅中温浴1 h，10 min左右晃动1次，取出，加5 μL蛋白酶K，37 ℃水浴2 h，加氯仿600 μL，混匀，12 000 r/min离心5 min，取上清液，再加入450 μL CTAB混匀，12 000 r/min离心5 min，取上清液。2次上清液合为1管，加等体积氯仿，12 000 r/min离心5 min，取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，12 000 r/min离心10 min，用80%乙醇洗涤，晾干。加200 μL TE（10.00 mmol/L Tris-Cl、1.00 mmol/L EDTA，pH=8.0）缓冲液溶解，采用Eppendorf公司的核酸定量检测仪（Biophotometer 6131）测定OD260/OD280值和 DNA 浓度，置于-20 ℃存放。

1.3CTAB提取方法 参照姚大彬等[11]的方法提取7种豆象基因组DNA，采用Eppendorf公司的核酸定量检测仪（Biophotometer 6131）测定 OD260/OD280值和 DNA 浓度，置于-20 ℃存放。

1.4SDS提取方法 参照葛风伟等[12]的方法提取7种豆象基因组DNA，采用Eppendorf公司的核酸定量检测仪（Biophotometer 6131）测定 OD260/OD280值和 DNA 浓度，置于-20 ℃存放。

1.5DNA完整性验证将以豆象干标本DNA提取方法提取的7种豆象DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统观察、照相，观察DNA提取情况，验证提取模板的完整性。

1.6PCR验证 以豆象干标本提取方法提取的7种豆象DNA模板，利用鞘翅目昆蟲DNA条形码通用引物COⅠ序列进行扩增，确认提取的DNA是否能扩增出目的条带。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，引物1：5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′；引物2：5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′。反应体系和反应程序参照刘翠霞等[13]的方法。PCR 产物上样至 1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统观察、照相，观察是否有目的条带产生。

2结果与分析

2.1DNA纯度和浓度比较对于昆虫类标本的基因组DNA提取，一般认为OD260/OD280值在1.70～1.90，DNA样品较纯。低于1.70说明样品中含有少量蛋白质及酚类物质，高于1.90说明RNA对DNA的污染较大。使用核酸定量检测仪测定OD260/OD280值，对DNA纯度进行分析，结果见表1。通过比较发现，采用豆象干标本提取方法提取的7种豆象标本DNA的OD260/OD280值基本上集中在1.70～1.90，符合基因组DNA提取的要求。采用CTAB方法提取的DNA OD260/OD280值大于1.90（花生豆象除外），表明CTAB法提取的干标本DNA存在少部分RNA污染。采用SDS法提取的DNA OD260/OD280值均小于1.70，表明SDS法提取的干标本DNA存在蛋白质及酚类物质。

使用核酸定量检测仪对DNA浓度进行分析，结果见表2。发现3种方法提取的基因组DNA浓度均能达到PCR反应的可用值。相比较而言，仅就DNA浓度值来说，CTAB法提取DNA浓度最大，SDS法提取DNA浓度最小。

综合DNA的纯度和浓度可知，豆象干标本提取方法比较适合后续PCR试验的开展。

2.2DNA的完整性制备过程中，在用异丙醇沉淀时，已经能用肉眼观察到絮状沉淀。琼脂糖凝胶电泳结果显示（图1），以豆象干标本DNA提取方法提取的7种豆象基因组DNA均可见清晰条带，DNA条带基本呈线形，很少有拖尾及弥散现象，说明提取的DNA杂质较少，较为完整。

2.3PCR验证结果用设计好的COⅠ通用引物对前面所提取的7种豆象基因组DNA进行PCR检测，结果见图2。PCR结果显示，所有豆象的基因组DNA均有特异性条形码目的条带出现扩增，大小与文献报道一致，说明所提取的DNA适合于后续分子试验的开展。

3讨论与结论

在该试验中，通过查阅资料和参照其他DNA提取方法，改进了豆象干标本的DNA提取方法，通过试验总结出从豆象干标本中提取基因组DNA的关键处理措施。在长时间保存在标本馆或博物馆里的干标本中，基因组DNA降解很严重并且存在影响PCR扩增的因素。将干标本置于STE缓冲液里浸渍过夜，然后用去离子水冲洗，虽然比一般DNA提取方法时间上略显长，但是对于豆象干标本来说，此举在于减少提取中基因组DNA的机械断裂和其他阻断，有利于保护干标本基因组DNA的完整性，减轻或排除其对PCR扩增的影响，因而十分有必要。

在此试验中，采用玻璃研磨器取代传统的液氮冷冻研磨。传统的液氮研磨具有快速、省时、粉碎程度好的优点，但是在操作中会使样本产生水气，影响样品质量。且由于液氮研磨过程中样本损耗较大，对于豆象标本一般需要10头以上才能进行研磨，实际工作中可操作样本量一般很少，不足以用液氮研磨。使用玻璃研磨器可以对单头虫体甚至虫体残骸进行样品研磨，在检验检疫工作中有着重要的意义。

研磨之后，在CTAB抽提液中加入β-巯基乙醇，起到了还原、保护DNA的目的，并且加快了蛋白质失活，提高了最终提取物的纯度和浓度。在65 ℃水浴之后，加入蛋白酶K并温浴2 h，消解了提取核酸中的杂质，提高了最终提取物的纯度。

在该方法提取中，本身就有一个核酸反复提取的过程。通过核酸的反复提取，提高了最终提取物的浓度。通过测定OD260/OD280值，DNA完整性试验，PCR验证试验充分证明了此豆象干标本DNA提取方法的有效性。该方法能够充分利用标本室和历年来积累的昆虫标本进行科学研究，缩短了研究时间，节省了人力物力。

45卷14期李金庆等豆象干标本基因组DNA提取方法的改进参考文献

[1] 王芙蓉，吳薇，荣德福.分子生物学技术在检疫性昆虫鉴定中的应用前景[J].安徽农业科学，2008，36（8）：3149-3151，3162.

[2] 叶兼菱，安榆林，钱路，等.检疫性昆虫DNA条形码检测技术的研发与应用实例[J].应用昆虫学报，2015，52（2）：382-389.

[3] 王玉生，万方浩，张桂芬.DNA条形码技术在农林入侵害虫鉴定与溯源研究中的应用[J]. 中国科学（生命科学），2016，46（5）：596-612.

[4] 孔秋蓮，叶军，岳玲，等.快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法研究[J].华北农学报，2010，25（1）：226-230.

[5] 伍祎，李志红，康芬芬，等.微卫星DNA标记及其在检疫性实蝇种群遗传学中的研究应用[J].植物保护，2007，33（4）：1-6.

[6] 陈梦义.口岸截获天牛科昆虫DNA条形码试剂盒的研究[D].南京：南京林业大学， 2015.

[7] 郑斯竹.天牛科基因条形码构建及分子快速鉴定技术研究[D].南京：南京林业大学， 2012.

[8] 张德华，周开亚，孙红英.乙醇保存的动物标本基因组DNA 提取方法比较[J].生物学杂志，2004，21（6）：46-48.

[9] 李枷霖，郑斯竹，蔡平，等.不同预处理方法影响昆虫干标本DNA 提取效果[J].基因组学与应用生物学，2015，34（2）：396-402.

[10] 印红，刘晓丽，王彦芳，等.一种改进的昆虫基因组DNA的提取方法[J].河北大学学报（自然科学版），2002，22（1）：80 -82.

[11] 姚大彬，迟德富，宇佳，等.一种改良的鞘翅目昆虫核酸的提取方法[J].东北林业大学学报，2009，37（1）：86-88.

[12] 葛风伟，季荣，曾献春，等.西伯利亚蝗基因组DNA 提取及RAPD分析条件的优化[J].昆虫知识，2007，44（4）：505-508.

[13] 刘翠霞，林恭华，苏建平，等.基于mtDNA COⅠ基因的DNA条形码技术鉴定鞘翅目幼虫[J].草业科学，2013，30（8）：1253-1258.